酶分析法-課件

1、8酶分析法 ppt課件8酶分析法 ppt課件教學(xué)目的和要求 熟悉： 1酶活力的測(cè)定方法 2酶法分析的測(cè)定方法了解：酶分析法的原理教學(xué)目的和要求 熟悉：概 述1.酶的概念是生物體內(nèi)產(chǎn)生并具有催化活性的一類蛋白質(zhì)，由于表現(xiàn)出特異的催化功能，因此酶被稱為生物催化劑。2.酶的應(yīng)用：在體外進(jìn)行催化反應(yīng)用以制造某些產(chǎn)品用以去除某些物質(zhì)用以識(shí)別某種化合物 屬于“酶分析法”用以測(cè)定某種物質(zhì)概 述1.酶的概念是生物體內(nèi)產(chǎn)生并具有催化活性的一類蛋白質(zhì)酶分析法-課件酶分析法-課件概 述3.酶分析法包括兩種類型：一是以酶作為分析對(duì)象，這類分析方法稱為“酶活力測(cè)定”。二是以酶作為分析手段，用以測(cè)定樣品中用一般化學(xué)方法難

2、于檢測(cè)的物質(zhì)，通常將這類分析方法稱為“酶法分析”；概 述3.酶分析法包括兩種類型：4.兩類酶分析法的區(qū)別相同：從原理到方法不同： 酶活力測(cè)定法中，是以酶為分析對(duì)象。使用的底物應(yīng)該過(guò)量。酶法分析中，是以酶為分析工具或分析試劑,被檢化合物（如：底物）是反應(yīng)的限制因素4.兩類酶分析法的區(qū)別酶法分析的優(yōu)點(diǎn)1 用于復(fù)雜組分中結(jié)構(gòu)或物理化學(xué)性質(zhì)比較相近的同類物質(zhì)的分離鑒定和分析。2 特異性強(qiáng)、干擾少、操作簡(jiǎn)單、樣品和試劑用量少，測(cè)定快速精確，靈敏度高等特點(diǎn)。3 通過(guò)了解酶對(duì)底物的特異性，可以預(yù)料可能發(fā)生的干擾反應(yīng)并設(shè)法糾正。4 可用偶聯(lián)反應(yīng)。5 無(wú)污染或污染很少的分析方法。酶法分析的優(yōu)點(diǎn)1 用于復(fù)雜組分中

3、結(jié)構(gòu)或物理化學(xué)性質(zhì)比較相近的共同點(diǎn)：原理和方法相同，以酶的專一高效催化某化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過(guò)測(cè)定酶反應(yīng)的速率或生成物濃度來(lái)檢測(cè)相應(yīng)物質(zhì)的含量。共同點(diǎn)：原理和方法相同，以酶的專一高效催化某化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)， 酶法測(cè)定的原則1、酶活性的測(cè)定2、代謝物濃度的測(cè)定3、酶底物復(fù)合物 酶法測(cè)定的原則1、酶活性的測(cè)定2、代謝物濃度的測(cè)定3、酶底酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)1、米氏方程1）. 米氏方程Km 即為米氏常數(shù)，Vmax為最大反應(yīng)速度當(dāng)反應(yīng)速度等于最大速度一半時(shí),即V = 1/2 Vmax, Km = S 上式表示,米氏常數(shù)是反應(yīng)速度為最大值的一半時(shí)的底物濃度。因此,米氏常數(shù)的單位為mol/L。酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)1、米氏方程

4、1）. 米氏方程Km 即為米氏常數(shù)2、Km米氏常數(shù)意義及推導(dǎo)過(guò)程不同的酶具有不同的Km值，它是酶的一個(gè)重要的特征物理常數(shù)。Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測(cè)定的，不同條件下具有不同的Km值。Km值表示酶與底物之間的親和程度：Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低; Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。 2、Km米氏常數(shù)意義及推導(dǎo)過(guò)程不同的酶具有不同的Km值，它是計(jì)算題要求酶按其最大反應(yīng)速度的99%的速度進(jìn)行反應(yīng)，求所需底物濃度S。已知S9Km,求該酶體系的反應(yīng)速度為何值？過(guò)氧化氫酶的Km為2.5102mol/L，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?00mmol/L時(shí)，求反應(yīng)速度達(dá)

5、到最大速度的百分?jǐn)?shù)？計(jì)算題要求酶按其最大反應(yīng)速度的99%的速度進(jìn)行反應(yīng)，求所需底第一節(jié) 酶活力測(cè)定法 一、基本概念 二、酶促反應(yīng)的條件 三、酶活力的測(cè)定方法 四、測(cè)定過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題 第一節(jié) 酶活力測(cè)定法 一、基本概念 一、基本概念1.酶活力：指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。2.酶活力的測(cè)定：是測(cè)定一個(gè)被酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的速度。3.酶活力測(cè)定的目的：通過(guò)酶反應(yīng)速度的測(cè)定，求得酶的濃度或含量一、基本概念1.酶活力：指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力(enzyme activity)的測(cè)定 1酶活力酶活力是指酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力，酶活力的大小可以用在一定條件下所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率來(lái)表

6、示，酶催化的反應(yīng)速率愈大，酶的活力愈高；反應(yīng)速率愈小，酶的活力就愈低。兩者呈線性關(guān)系。所以測(cè)定酶的活力就是測(cè)定酶促反應(yīng)的速率。 酶活力(enzyme activity)的測(cè)定 1酶活力酶催化的反應(yīng)速率可用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來(lái)表示。在實(shí)際酶活測(cè)定中一般以測(cè)定產(chǎn)物的增加量為準(zhǔn)。V = p / t p = v t酶催化的反應(yīng)速率可用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來(lái)表引起酶促反應(yīng)速率降低的原因(1)底物濃度的降低；(2)產(chǎn)物濃度增加加速了逆反應(yīng)的進(jìn)行；(3)產(chǎn)物對(duì)酶的抑制或激活作用(4)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)引起酶本身部分分子失活等。因此測(cè)定酶活力，應(yīng)測(cè)定酶促反應(yīng)的初速率，反應(yīng)初速率與

7、酶量呈線性關(guān)系，因此可以用初速率來(lái)測(cè)定制劑中酶的含量。 引起酶促反應(yīng)速率降低的原因(1)底物濃度的降低；檢驗(yàn)酶反應(yīng)和測(cè)定系統(tǒng)是否適宜的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)得的反應(yīng)速度必須和酶濃度間有線性的比例關(guān)系檢驗(yàn)酶反應(yīng)和測(cè)定系統(tǒng)是否適宜的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)得的反應(yīng)速度必須和酶濃度一、基本概念4.酶反應(yīng)的速度：用單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的增加來(lái)表示，酶反應(yīng)的速度愈快所表示的酶活力愈高。5.測(cè)定酶活力的方法：可用物理法、化學(xué)法或酶分析法等方法。一、基本概念4.酶反應(yīng)的速度：用單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)一、基本概念6.常用的酶分析法第一，終點(diǎn)法第二，取樣測(cè)定法第三，連續(xù)測(cè)定法一、基本概念6.常用的酶分析法一、基本概念7.酶的活性

8、單位（國(guó)際單位U）：在25及最適條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一個(gè)微摩爾(mol)底物的酶量定為一個(gè)活性單位。8.酶的比活性：為一毫克(mg)酶的活性單位數(shù)目。 一、基本概念國(guó)際酶活力單位1961年,國(guó)際生物化學(xué)協(xié)會(huì)酶學(xué)委員會(huì)提出采用統(tǒng)一的“國(guó)際單位”(U)來(lái)表示酶活力，規(guī)定為：在最適反應(yīng)條件(溫度25)下，每分鐘內(nèi)催化1微摩爾(umo1)底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量,定為一個(gè)酶活力單位，即 1 U = 1 umolmin。 國(guó)際酶活力單位1961年,國(guó)際生物化學(xué)協(xié)會(huì)酶學(xué)委員會(huì)提出采用酶的比活力(specific activity)比活力:每mg蛋白質(zhì)所含的酶活力單位數(shù)表示，比活力=活力Umg蛋白=總活力U

9、/總蛋白mg有時(shí)用每g酶制劑或每m1酶制劑含有多少個(gè)活力單位來(lái)表示(Ug或Uml)。比活力大小的含義：可用來(lái)比較每單位質(zhì)量蛋白質(zhì)的催化能力。比活力愈大，表示酶的純度愈高。酶的比活力(specific activity)比活力:每m活力單位(U)與比活力U速度單位每小時(shí)催化1克底物每小時(shí)催化1ml某濃度溶液每分鐘催化1ug底物酶產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)中常使用比活力單位質(zhì)量酶產(chǎn)品中酶活力稱比活力。 u/mg酶蛋白 u/ml酶蛋白國(guó)際單位（IU）：在實(shí)驗(yàn)規(guī)定的條件下（25，最適pH、最適底物濃度時(shí)），1ul標(biāo)本，以每分鐘能催化1微摩爾底物的酶量為1個(gè)國(guó)際單位?；盍挝?U)與比活力U速度單位酶促反應(yīng)速度的測(cè)定

10、方法產(chǎn)物濃度變化曲線提問(wèn)：為什么反應(yīng)速度會(huì)隨時(shí)間減?。看鸢福?.S降低； 2.酶受到產(chǎn)物抑制提問(wèn)：用哪一個(gè)速度來(lái)表示該酶促反應(yīng)的速度特征呢？反應(yīng)初速度 Vo反應(yīng)初速度表示酶活力。提問(wèn)：僅用反應(yīng)初速度大小對(duì)比酶活力行嗎？答案：不行，還與酶的加入量及條件有關(guān)。酶促反應(yīng)速度的測(cè)定方法產(chǎn)物濃度變化曲線提問(wèn)：為什么反應(yīng)速度會(huì)酶活力測(cè)定實(shí)例首先 確定反應(yīng)條件 20、pH=7，底物濃度 6g/l（過(guò)量），加入2mg固體脂肪酶第二 確定活力單位 如每小時(shí)催化1克底物 1u= 1g/h第三 測(cè)算反應(yīng)初速度 作產(chǎn)物甘油隨時(shí)間增加的曲線，量出反應(yīng)初速度值 ，換算為脂肪的消耗速度 如 8g/h第四 換算活力 8g/h

11、 / 1g/h=8u第五 計(jì)算比活 8u/2mg酶蛋白=4u/mg酶蛋白脂肪脂肪酶甘油 + 脂肪酸酶活力測(cè)定實(shí)例首先 確定反應(yīng)條件 20、pH=7，底 活性部位 活性 作 業(yè)根據(jù)所學(xué)知識(shí)推導(dǎo)出米氏方程。 作 業(yè)根據(jù)所學(xué)知識(shí)推導(dǎo)出米氏方程。二、酶促反應(yīng)的條件基本要求：反應(yīng)系統(tǒng)中除了待測(cè)酶的濃度是影響速度的惟一因素外，其他因素都處于最適于酶發(fā)揮催化作用的水平。 二、酶促反應(yīng)的條件基本要求：確定反應(yīng)條件時(shí)應(yīng)考慮： （1）底物 選用的底物在物理化學(xué)性質(zhì)上和產(chǎn)物不同。 一般選用底物的濃度S=100 Km 一般選擇Km小的作測(cè)定的底物。 確定反應(yīng)條件時(shí)應(yīng)考慮：（2）pH值 注意選擇適宜的反應(yīng)pH值，并將反

12、應(yīng)維持在這一pH值。例：丙酮酸 乳酸乳酸脫氫酶（2）pH值 注意選擇適宜的反應(yīng)pH值，并將反應(yīng)維持在pH對(duì)酶反應(yīng)的影響pH對(duì)酶反應(yīng)的影響 pH影響酶活力的原因 (1) 過(guò)酸或過(guò)堿可以使酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，引起酶構(gòu)象的改變，酶活性喪失。(2) 當(dāng)pH改變不很劇烈時(shí)，酶雖未變性，但活力受到影響。影響了底物的解離狀態(tài)；影響酶分子活性部位上有關(guān)基團(tuán)的解離；影響到中間絡(luò)合物ES的解離狀態(tài)，不利于催化生成產(chǎn)物。 pH影響酶活力的原因 (1) 過(guò)酸或過(guò)堿可以使酶的空間結(jié)構(gòu)二、酶促反應(yīng)的條件 （3）溫度 實(shí)驗(yàn)中溫度變動(dòng)應(yīng)控制在0.1以內(nèi)。酶反應(yīng)的溫度通常選用25、30、37。 （4）輔助因子 為了提高酶在反應(yīng)系

13、統(tǒng)中的穩(wěn)定性，有些也需要某些相應(yīng)的物質(zhì)。 二、酶促反應(yīng)的條件 （3）溫度 實(shí)驗(yàn)中溫度變動(dòng)應(yīng)控制在0最適溫度 機(jī)理：溫度導(dǎo)致酶蛋白變性溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響最適溫度 機(jī)理：溫度導(dǎo)致酶蛋白變性溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響在最適溫度之前，一般溫度越高，反應(yīng)速度就越快。酶的固體狀態(tài)比在溶液中對(duì)溫度的耐受力要高。通常酶制劑以固體保存為佳。溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響在最適溫度之前，一般溫度越高，反應(yīng)速度就越（5）空白和對(duì)照 空白 指雜質(zhì)反應(yīng)和自發(fā)反應(yīng)引起的變化量，提供未知因素的影響 對(duì)照作為比較或標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)。（5）空白和對(duì)照 三、酶活力的測(cè)定方法按取樣及檢測(cè)的方式（一）取樣測(cè)定法（二）連續(xù)測(cè)定法三、酶活力的測(cè)

14、定方法（一）取樣測(cè)定法1.取樣測(cè)定法：求得單位時(shí)間內(nèi)酶促反應(yīng)變化量的方法。 2.常用的檢測(cè)方法：紫外-可見(jiàn)分光光度法、熒光分析法等。（一）取樣測(cè)定法1.取樣測(cè)定法：求得單位時(shí)間內(nèi)酶促反應(yīng)變化量取樣測(cè)定法 在酶反應(yīng)開(kāi)始后不同的時(shí)間，從反應(yīng)系統(tǒng)中取出一定量的反應(yīng)液，并用適當(dāng)?shù)姆椒ǎㄌ砑用傅淖冃詣┗蚴姑甘Щ睿┩Ｖ蛊浞磻?yīng)后，再根據(jù)產(chǎn)物和底物在化學(xué)性質(zhì)上的差別，選用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法進(jìn)行定量分析，求得單位時(shí)間內(nèi)酶促反應(yīng)變化量的方法。取樣測(cè)定法 在酶反應(yīng)開(kāi)始后不同的時(shí)間，從反應(yīng)系統(tǒng)中取出一取樣測(cè)定法取樣測(cè)定法一直沿襲至今是因?yàn)椋翰恍枰厥鈨x器幾乎所有酶反應(yīng)都可根據(jù)產(chǎn)物或底物的化學(xué)性質(zhì)找出具體的測(cè)定方法由于色源

15、底物和熒光源底物的發(fā)展，可在原來(lái)的底物分子上接上相應(yīng)的有色基團(tuán)、發(fā)色基團(tuán)或熒光基團(tuán)。取樣測(cè)定法取樣測(cè)定法一直沿襲至今是因?yàn)椋?、終止酶反應(yīng)：添加酶的變性劑三氯醋酸：紫外光區(qū)有吸收高氯酸：對(duì)酸和氧化劑敏感的對(duì)象不適用3、終止酶反應(yīng)：添加酶的變性劑4、特點(diǎn)：不需要特殊儀器容易找到具體測(cè)定方法色源底物和熒光源底物發(fā)展快4、特點(diǎn)： （二）連續(xù)測(cè)定法1.連續(xù)測(cè)定法：基于底物和產(chǎn)物在物理化學(xué)性質(zhì)上的不同，在反應(yīng)過(guò)程中對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行直接連續(xù)檢測(cè)的方法。2.常用的檢測(cè)方法 （二）連續(xù)測(cè)定法1.連續(xù)測(cè)定法：基于底物和產(chǎn)物在物理化學(xué)性連續(xù)測(cè)定法基于底物和產(chǎn)物在物理化學(xué)性質(zhì)上的不同，在反應(yīng)過(guò)程中對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行連續(xù)檢

16、測(cè)的方法。 連續(xù)測(cè)定法的準(zhǔn)確性和測(cè)定效率比較好連續(xù)測(cè)定法基于底物和產(chǎn)物在物理化學(xué)性質(zhì)上的不同，在反應(yīng)過(guò)程中酶活不能反映酶的使用效果 只能用于產(chǎn)品質(zhì)量的控制酶活不能反映酶的使用效果 只能用于產(chǎn)品測(cè)定過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題產(chǎn)物的測(cè)定反應(yīng)速度的測(cè)定測(cè)定要達(dá)到的要求測(cè)定過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題產(chǎn)物的測(cè)定酶反應(yīng)進(jìn)程曲線012345605101520t/minc/mg/mL5040302010酶量生化藥物制劑檢驗(yàn)程序酶反應(yīng)進(jìn)程曲線012345605101520t/minc/m生化藥物制劑檢驗(yàn)程序酶濃度曲線的關(guān)系00.10.20.30.40.50.60102030405060酶量反應(yīng)速率t=15t=10t=5t/mi

17、n生化藥物制劑檢驗(yàn)程序酶濃度曲線的關(guān)系00.10.20.30.酶分析法的檢測(cè)方法酶分析法的檢測(cè)方法最常用的方法介紹如下：(1) 紫外-可見(jiàn)分光光度法(2) 熒光分析法(3) 旋光度法(4) 酶偶聯(lián)測(cè)定法(5) 其他檢測(cè)法酶分析法的檢測(cè)方法最常用的方法介紹如下：酶分析法的檢測(cè)方法一、紫外-可見(jiàn)分光光度法 NAD+ (煙酰胺-腺嘌呤二核苷酸，又稱為輔酶I) 和NADP+(煙酰胺-腺嘌呤磷酸二核苷酸,又稱為輔酶II )是維生素?zé)燉０返难苌?，一、紫?可見(jiàn)分光光度法 NAD+ (煙酰胺-腺嘌呤二核苷酸還原氧化NAD+NADH在338.5nm與340.5nm之間有一個(gè)最大吸收峰300-400nm無(wú)吸收

18、還原氧化NAD+NADH在338.5nm與340.5nm之3丙酮酸+NADH+H+LDH乳酸+NAD+例 1、例 2、天冬氨酸+a-草酰酮戊二酸谷氨酸+草酰乙酸GOT草酰乙酸+NADH+H蘋(píng)果酸+NAD+MDH丙酮酸+NADH+H+LDH乳酸+NAD+例 1、例 2、天酶偶聯(lián)測(cè)定法：是應(yīng)用過(guò)量、高度專一的“偶聯(lián)工具酶”使被測(cè)酶反應(yīng)能連續(xù)進(jìn)行到某一可直接、連續(xù)、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確測(cè)定階段的方法。被測(cè)反應(yīng)偶聯(lián)指示反應(yīng)酶偶聯(lián)測(cè)定法：是應(yīng)用過(guò)量、高度專一的被測(cè)反應(yīng)偶聯(lián)指示反應(yīng)被測(cè)反應(yīng)肌激酶輔助反應(yīng)丙酮酸激酶指示反應(yīng)乳酸脫氫酶被測(cè)反應(yīng)肌激酶輔助反應(yīng)丙酮酸激酶指示反應(yīng)乳酸脫氫酶二、熒光分析法三 華勃氏呼吸儀檢壓法

19、四、放射性同位素測(cè)定法二、熒光分析法三 華勃氏呼吸儀檢壓法四、放射性同位素測(cè)定法華勃氏微量呼吸儀（瓦氏呼吸儀） 華勃氏微量呼吸儀（瓦氏呼吸儀） 五 電化學(xué)法（electrochemical）pH測(cè)定法：用高靈敏度的pH計(jì)，跟蹤反應(yīng)過(guò)程中H+變化的情況，用pH的變化來(lái)測(cè)定酶的反應(yīng)速率。離子選擇電極法：測(cè)定某些酶的酶活力，用氧電極可以測(cè)定一些耗氧的酶反應(yīng)，如葡糖氧化酶的活力就可用這個(gè)方法很方便地測(cè)定。 五 電化學(xué)法（electrochemical）pH測(cè)定法：用第二節(jié) 酶法分析 一、終點(diǎn)測(cè)定法 二、反應(yīng)速度法 第二節(jié) 酶法分析 一、終點(diǎn)測(cè)定法 一、原理是在以待測(cè)物質(zhì)為底物的酶反應(yīng)中，如果能使底物能

20、夠接近完全地轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，而且底物或產(chǎn)物又具有某種特征性質(zhì)，通過(guò)直接測(cè)定轉(zhuǎn)化前后底物的減少量，產(chǎn)物的增加量或輔酶的變化就可以定量待測(cè)物平衡法 一、原理是在以待測(cè)物質(zhì)為底物的酶反應(yīng)中，如果能使底物能夠接近 用于復(fù)雜組分中結(jié)構(gòu)或物理化學(xué)性質(zhì)比較 相近的同類物質(zhì)的分離鑒定和分析。特異性強(qiáng)、干擾少、操作簡(jiǎn)單、樣品和試 劑用量少，測(cè)定快速精確，靈敏度高等特 點(diǎn)。通過(guò)了解酶對(duì)底物的特異性，可以預(yù)料可能 發(fā)生的干擾反應(yīng)并設(shè)法糾正?？捎门悸?lián)反應(yīng)。無(wú)污染或污染很少的分析方法。優(yōu) 點(diǎn) ： 用于復(fù)雜組分中結(jié)構(gòu)或物理化學(xué)性質(zhì)比較 相近一、終點(diǎn)測(cè)定法1.原理：先借助酶反應(yīng)（單獨(dú)的反應(yīng)或幾種酶構(gòu)成的偶數(shù)酶反應(yīng)）使被測(cè)物質(zhì)定

21、量地進(jìn)行轉(zhuǎn)變，然后在轉(zhuǎn)化完成后，測(cè)定底物、產(chǎn)物或輔酶物質(zhì)（第二底物）等的變化量。2.一般采用的測(cè)定方法：光吸收、熒光之類的分光光度法測(cè)定氣體產(chǎn)生與吸收的測(cè)壓量氣法（華勃氏呼吸儀檢壓法）檢知pH值變化的滴定法同位素跟蹤測(cè)定法一、終點(diǎn)測(cè)定法1.原理：先借助酶反應(yīng)（單獨(dú)的反應(yīng)或幾種酶構(gòu)成（一）終點(diǎn)法條件 1酶的底物特異性（專一性）：具有高度的底物專一性，有一些酶是呈族特異性； 2反應(yīng)的平衡 ：酶反應(yīng)若平衡十分偏向進(jìn)行方向，則可方便地用終點(diǎn)測(cè)定法檢測(cè)；但若反應(yīng)的平衡并不十分偏向進(jìn)行方向，或者偏向逆方向，此時(shí)由于反應(yīng)不能完全，因而反應(yīng)就不能正確定量，解決這一問(wèn)題，通?？刹扇∫恍┐胧?（一）終點(diǎn)法條件

22、1酶的底物特異性（專一性）：具有高度的反應(yīng)的平衡谷氨酸+NAD+H2Oa-酮戊二酸+NADH+NH+谷氨酸脫氫酶NADH+丙酮酸乳酸+ NAD+乳酸脫氫酶反應(yīng)的平衡谷氨酸+NAD+H2Oa-酮戊二酸+NADH+N 3反應(yīng)液中的酶量 ：要使酶反應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)完成，只有使用對(duì)底物親和性很大的酶（即Km要?。?，酶用量（即Vmax）必須大才能達(dá)到此點(diǎn)。工作中，在10min內(nèi)反應(yīng)完成99%，則常數(shù)K以1.0min-1為宜。 4反應(yīng)產(chǎn)物抑制：如果產(chǎn)物對(duì)反應(yīng)本身有抑制作用，則會(huì)妨礙反應(yīng)進(jìn)行，在這種情況下可將該產(chǎn)物除去或者和再生系統(tǒng)偶聯(lián)等辦法解決。 3反應(yīng)液中的酶量 ：要使酶反應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)完成，只有使用對(duì)反應(yīng)產(chǎn)

23、物抑制S+ATPP+ADP丙酮酸丙酮酸激酶磷酸烯醇式丙酮酸S激酶反應(yīng)產(chǎn)物抑制S+ATPP+ADP丙酮酸丙酮酸激酶磷酸烯醇式丙（二）終點(diǎn)法種類1單酶反應(yīng)定量法：（1）底物減少量的測(cè)定：在以待測(cè)物質(zhì)為底物的酶反應(yīng)中，如果底物能接近完全地轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，且又具有某種特征性質(zhì)（例如特征的吸收譜帶）時(shí)，則就可能簡(jiǎn)便地通過(guò)直接測(cè)定底物的減少量，而定量待測(cè)物。 （二）終點(diǎn)法種類1單酶反應(yīng)定量法：（二）終點(diǎn)法種類（2）產(chǎn)物增加量的測(cè)定：在以被測(cè)物為底物的酶的反應(yīng)中，如果底物基本上都能轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，而產(chǎn)物又具有可以專一地進(jìn)行定量測(cè)定的性質(zhì)，那么根據(jù)產(chǎn)物增加就能檢知底物的量。（3）輔酶變化量的測(cè)定：以NAD或NADP為

24、輔酶的脫氫酶反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定340nm吸收度的變化，就能對(duì)作為相應(yīng)脫氫酶底物的物質(zhì)進(jìn)行定量分析。 （二）終點(diǎn)法種類（2）產(chǎn)物增加量的測(cè)定：在以被測(cè)物為底物的酶1. 羥基丙酮酸的定量測(cè)定羥基丙酮酸+NADH+HD甘油酸+NAD+L-谷氨酸+NAD+H2O甘油酸脫氫酶2. L-谷氨酸的定量測(cè)定a-酮戊二酸+NADH+NH4+谷氨酸脫氫酶1. 羥基丙酮酸的定量測(cè)定羥基丙酮酸+NADH+HD甘油2和指示酶反應(yīng)偶聯(lián)的定量法（1）以脫氫酶為指示劑：用來(lái)作為偶聯(lián)指示劑的酶中應(yīng)用得最廣泛的是以NAD或NADP為輔酶的脫氫酶類 （2）以脫氫酶以外的酶作指示劑：參與某些色素氧化還原的酶中有的可用作指示劑，反應(yīng)的進(jìn)行

25、可由吸收度的變化來(lái)測(cè)定。 2和指示酶反應(yīng)偶聯(lián)的定量法2、和指示酶反應(yīng)偶聯(lián)的定量法以脫氫酶為指示劑1-磷酸-葡萄糖6-磷酸-葡萄糖磷酸葡萄糖變位酶1，6-二磷酸葡萄糖6-磷酸-葡萄糖+NADP6-磷酸-葡萄糖醛酸+NADPH+H+6-磷酸-葡萄糖脫氫酶2、和指示酶反應(yīng)偶聯(lián)的定量法以脫氫酶為指示劑1-磷酸-葡萄D-2-磷酸甘油酸磷酸烯醇丙酮酸烯醇化酶磷酸烯醇丙酮酸+ADP丙酮酸激酶丙酮酸+ATP丙酮酸+NADH+H+乳酸脫氫酶乳酸+NAD+D-2-磷酸甘油酸磷酸烯醇丙酮酸烯醇化酶磷酸烯醇丙酮酸+AD以脫氫酶以外的酶為指示劑D-葡萄糖的定量測(cè)定葡萄糖葡萄糖醛酸+H2O2H2O2 +4-氨基安替比林酚醌亞膠色素+4H2O葡萄糖氧化酶過(guò)氧化物酶以脫氫酶以外的酶為指示劑D-葡萄糖的定量測(cè)定葡萄糖葡萄糖醛二、反應(yīng)速度法反應(yīng)速度法是在一定條件下（一定pH值和溫度），測(cè)定反應(yīng)的初速度，而反應(yīng)的初速度與被測(cè)物質(zhì)的濃度成正比關(guān)系，因此可根據(jù)初速度計(jì)算被測(cè)物質(zhì)的量，也可利用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照法計(jì)算被測(cè)物質(zhì)的量。二、反應(yīng)速度法反應(yīng)速度法是在一定條件下（一定pH值和溫度），特 點(diǎn) ：測(cè)定速度快試劑用量少成本低對(duì)濁度和色素的干擾不敏感不需要考慮反應(yīng)是否進(jìn)行完全特 點(diǎn) ：