食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中T-2毒素的測(cè)定

1、 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中T-2毒素的測(cè)定范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中T-2毒素的測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于谷物，酒類(lèi)，醬油、醋、醬及醬制品中T-2毒素含量的測(cè)定，第二法、第三法適用于谷物中T-2毒素的測(cè)定。本標(biāo)準(zhǔn)的方法檢出限：第一法的對(duì)谷物的檢出限為10g/kg，對(duì)酒類(lèi)、醬油、醋、醬及醬制品的檢出限為5g/kg。第二法的檢出限為1g/kg。第三法中直接法一的檢出限為1g/kg，直接法二的檢出限為3.5g/kg。第一法 免疫親和層析凈化液相色譜法原理用提取液提取試樣中的T-2毒素，經(jīng)免疫親和柱凈化，濃縮、衍生、定容后，用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法定量。試劑和材料 除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純

2、，水為蒸餾水或相當(dāng)純度的去離子水。3.1 甲醇（CH3OH）：HPLC級(jí)。3.2 乙腈（CH3CN）：HPLC級(jí)。3.3 甲苯（C6H5CH3）：HPLC級(jí)。3.4 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇，加20mL水。3.5 4-二甲基氨基吡啶（DMAP）溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.0325g于100mL容量瓶中，用甲苯稀釋至刻度。3.6 1-氰酸蒽（1-anthroylnitrile，1-AN）溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.0300g于100mL容量瓶中，用甲苯稀釋至刻度。3.7 T-2毒素（T-2 toxin）標(biāo)準(zhǔn)品：純度98%。免疫親和柱。3.8 T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配成濃

3、度為0.5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20避光保存。使用前用乙腈稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。3.9 T-2毒素免疫親和柱。3.10 玻璃纖維濾紙。儀器和設(shè)備4.1 液相色譜儀配有熒光檢測(cè)器。4.2 粉碎機(jī)：轉(zhuǎn)速10000r/min。4.3 高速均質(zhì)器：轉(zhuǎn)速大于10000r/min。4.4 氮吹儀。4.5 離心機(jī)。4.6 渦旋混合儀。4.7 空氣壓力泵。4.8 試驗(yàn)篩：1mm孔徑。4.9 天平：感量0.001 g。4.10 超聲波發(fā)生器：功率大于180W。4.11 玻璃注射器：10 mL。分析步驟5.1 提取5.1.1 谷物將樣品研磨，硬質(zhì)的谷物用粉碎機(jī)（4.2）磨細(xì)并通過(guò)試驗(yàn)篩（4.8），不要磨

4、成粉末。稱(chēng)取25g（精確到0.01g）磨碎的試樣于容量瓶中，用甲醇-水（8+2）（3.4）定容至100mL，混勻，轉(zhuǎn)移至均質(zhì)杯中高速均質(zhì)2min。定量濾紙過(guò)濾，移取10.0mL濾液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混勻，用玻璃纖維濾紙（3.10）過(guò)濾至澄清，收集濾液于干凈的容器中。5.1.2 醬油、醋、醬及醬制品稱(chēng)取25g（精確到0.01g）混勻的試樣，用甲醇（3.1）定容至50.0mL，超聲提取10min，定量濾紙過(guò)濾，移取10.0mL濾液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混勻，用玻璃纖維濾紙（3.10）過(guò)濾至澄清，收集濾液于干凈的容器中。5.1.3 酒類(lèi)取脫氣酒類(lèi)試樣（含二氧化碳的酒類(lèi)

5、使用前先置于4冰箱冷藏30min，過(guò)濾或超聲脫氣）或其他不含二氧化碳的酒類(lèi)試樣20g（精確到0.01g）于50mL容量瓶中，用甲醇（3.1）定容至刻度，搖勻，定量濾紙過(guò)濾。移取10.0mL濾液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混勻，用玻璃纖維濾紙（3.10）過(guò)濾至澄清，收集濾液于干凈的容器中。5.2 凈化將免疫親和柱（3.9）連接于玻璃注射器下（4.11），準(zhǔn)確移取10.0ml 5.1中的提取濾液，注入玻璃注射器中。將空氣壓力泵（4.7）與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約1 滴/s的流速緩慢通過(guò)免疫親和柱，直至有部分空氣通過(guò)柱體。以10ml水淋洗柱子1次，流速約為1 滴/s2滴/s，直至空

6、氣進(jìn)入親和柱中，棄去全部流出液，抽干小柱。5.3 洗脫準(zhǔn)確加入1.0 mL甲醇洗脫，流速約為1滴/s，收集全部洗脫液于干凈的玻璃試管中。5.4 衍生5.4.1 T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液的衍生：取不同濃度的T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液各1mL，在50 下用氮?dú)獯蹈?，加?0L 4-二甲基氨基吡啶（DMAP）溶液（3.5）和50uL 1-氰酸蒽（1-AN）溶液（3.6），在渦旋混合器上混勻1min，50反應(yīng)15min，在冰水中冷卻10min后取出，50 下氮?dú)獯蹈?，?.0mL流動(dòng)相（5.5）溶解，待HPLC測(cè)定。5.4.2 樣品的衍生：將5.3中洗脫液在50下用氮?dú)獯蹈?，?.4.1步驟進(jìn)行。5.5 液相色

7、譜參考條件a） 色譜柱：C18柱，5m，150mm4.6mm或相當(dāng)者；b） 流動(dòng)相：乙腈+水（75+25）；c） 流速：1.0mL/min；d） 柱溫：35；c） 進(jìn)樣量：20L；f） 檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)381nm，發(fā)射波長(zhǎng)470nm。5.6 色譜測(cè)定以T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)試樣進(jìn)行定量，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和試樣溶液中T-2毒素的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)線性范圍內(nèi)。在上述色譜條件下，T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖參見(jiàn)圖A.1。5.7 空白試驗(yàn)除不加試樣外，空白試驗(yàn)應(yīng)與測(cè)定平行進(jìn)行，并采用相同的分析步驟。5.8 平行試驗(yàn)按以上步驟，對(duì)同一試樣

8、進(jìn)行平行試驗(yàn)測(cè)定。5.9 結(jié)果計(jì)算5.9.1 糧食及糧食樣品：試樣中T-2毒素含量按式（1）計(jì)算： （1）式中：X試樣中T-2毒素的含量，單位為微克每千克（g/kg）；c1試樣溶液中T-2毒素的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；c0空白試樣溶液中T-2毒素的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V衍生化后甲醇定容體積，單位為毫升（mL）。m試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；f稀釋倍數(shù)。檢測(cè)結(jié)果以?xún)纱螠y(cè)定值的算術(shù)平均值表示。計(jì)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后1位。6回收率樣品中T-2毒素添加濃度在10 g/kg100 g/kg時(shí)，回收率在80 %110 %之間。7 精密度在重復(fù)性條件下，獲得的T-2毒素的兩次

9、獨(dú)立測(cè)XX果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。第二法 間接法8 原理及依據(jù)將已知抗原吸附在固相載體表面，洗除未吸附抗原，加入 一定量抗體與待測(cè)試樣（含有抗原）提取液的混合液，競(jìng)爭(zhēng)溫育后 ，在固相載體表面形成抗原-抗體復(fù)合物。洗除多余抗體成分，然后加入酶標(biāo)記的抗球蛋白的第二抗體結(jié)合物，與吸附在固體表面的抗原-抗體復(fù)合物相結(jié)合，再加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物發(fā)生降解反應(yīng)，產(chǎn)生有色產(chǎn)物，通過(guò)酶標(biāo)檢測(cè)儀，測(cè)出酶底物的降解量，從而推知被測(cè)試樣中的抗原量。9 試劑和原料 除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。9.1 甲醇。9. 2 石油醚。9. 3 三氯甲

10、烷。9. 4 無(wú)水乙醇。9. 5 乙酸乙酯。9.6 二甲基甲酰胺。9.7 四甲基聯(lián)苯胺（TMB）。9.8 吐溫-20。9.9 30%過(guò)氧化氫（30%H2O2）。9.10 抗體：雜交瘤細(xì)胞系1D7產(chǎn)生的抗T-2毒素的特異性單克隆抗體。9.11 抗原：T-2毒素與載體蛋白-牛血清白蛋白（BSA）的結(jié)合物。9.12 兔抗鼠免疫球蛋白與辣根過(guò)氧化酶的結(jié)合物（酶標(biāo)二抗）。9.13 ELISA緩沖液系統(tǒng)。9.13.1 包被緩沖液為pH9.6的碳酸鹽緩沖液，稱(chēng)取1.59g碳酸鈉（Na2CO3）、2.93g碳酸氫鈉（NaHCO3），加水稀釋至1000mL。9.13.2 洗液為含0.05%吐溫-20的pH7.4

11、的磷酸鹽緩沖液（簡(jiǎn)稱(chēng)PBS-T）。配制方法為：稱(chēng)取0.2g磷酸二氫鉀（KH2PO4）、2.9g磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）、8.0g氯化鈉（NaCl）、0.2g氯化鉀（KCl）、0.5mL吐溫-20，加水至1000mL。9.13.3 第五緩沖液為pH5.0的磷酸-檸檬酸緩沖液，配制方法為： 0.1mol/L檸檬酸（C6H8O7H2O），稱(chēng)取檸檬酸19.2g，加水至1000mL，為甲液； 0.2mol/L磷酸氫二鈉（Na2HPO4），稱(chēng)取磷酸氫二鈉71.7g，加水至1000mL，為乙液；取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即可。9.13.4 底物溶液：取50L TM

12、B（10mg TMB溶于1mL二甲基甲酰胺中）溶液+10mL底物緩沖液+10L 30%過(guò)氧化氫，混勻。9.14 T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液：用甲醇配成1mg/mL T-2毒素儲(chǔ)備液，-20冰箱貯存。于檢測(cè)當(dāng)天，精密吸取貯備液，用20%甲醇的PBS（配備方法同PBS-T，不加吐溫-20即可）稀釋成制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的所需濃度。10 儀器和設(shè)備 所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡，用自來(lái)水、蒸餾水沖洗。10.1 酶標(biāo)檢測(cè)儀。10.2 酶標(biāo)板（40孔或96孔）。10.3 電動(dòng)振蕩器。10.4 電熱恒溫水浴鍋。10.5 具0.2mL尾管的10mL小濃縮瓶。11 分析步驟11.1 提取稱(chēng)取20g粉碎并通過(guò)20目篩的試樣，置

13、200mL具塞錐形燒瓶中，加8mL水和100mL三氯甲烷-無(wú)水乙醇（4+1），密塞，振蕩1h，通過(guò)濾紙過(guò)濾，取25mL濾液于蒸發(fā)皿中，置90水浴上通風(fēng)揮干。用50mL石油醚分次溶解蒸發(fā)皿中殘?jiān)慈?50mL分液漏斗中，再用20mL甲醇-水（4+1）分次洗滌，轉(zhuǎn)入同一分液漏斗中，振蕩1.5min，靜置約15min，收下層甲醇-水提取液過(guò)層析柱凈化（層析柱的裝備；在層析柱下端與小管相連結(jié)處塞約0.1g脫脂棉，盡量塞緊，先裝入0.5g中性氧化鋁，敲平表面，再加入0.4g活性碳，敲緊）。將過(guò)柱后的洗脫液倒入蒸發(fā)皿中，并于水浴鍋上濃縮至干，趁熱加3mL乙酸乙酯，加熱至沸，揮干，再重復(fù)一次，最后加3mL

14、乙酸乙酯，冷至室溫后轉(zhuǎn)入濃縮瓶中。用適量乙酸乙酯洗滌蒸發(fā)皿，并入濃縮瓶中，將濃縮瓶置95水浴鍋上，揮干冷卻后，用含20%甲醇的PBS定容，供ELISA檢測(cè)之用。11.2 ELISA檢測(cè)11.2.1 用T-2-BSA（4g/mL）包被酶標(biāo)板，每孔100L，4過(guò)夜。11.2.2 酶標(biāo)板用PBS-T洗3次，每次3min后，加入不同濃度的T-2標(biāo)準(zhǔn)溶液（制作標(biāo)準(zhǔn)曲線）或試樣提取液（檢測(cè)試樣中的毒素含量）與抗體溶液的混合液（1+1，每孔100L，該混合液應(yīng)于使用前的前一天配好，4過(guò)夜備用），置37 1h。11.2.3 酶標(biāo)板洗3次，每次3min后，加入酶標(biāo)二抗，每孔100L，37 1.5h。11.2.4

15、 同上述洗滌后，加入底物溶液，每孔100L，37 30min。11.2.5 用1mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)，每孔50L，于450nm處測(cè)定吸光度值。12 結(jié)果計(jì)算 樣品中T-2毒素的含量（c）以納克每克表示，按式（2）計(jì)算： （2）式中：cT-2濃度，單位為納克每克（ng/g）；m1酶標(biāo)板上所測(cè)得的T-2毒素的量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得，單位為納克（ng）；V1試樣提取液的體積，單位為毫升（mL）；V2滴加樣液的體積，單位為毫升（mL）；D樣液的總稀釋倍數(shù)；m試樣質(zhì)量，單位為克（g）；13 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)XX果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的20%。第三法 直接法14 原理及依據(jù)

16、14.1 直接法一：將已知抗原吸附在固相載體表面，洗除未吸附的抗原，加入一定量的酶標(biāo)記抗體與試樣（含有抗原）提取液的混合液，競(jìng)爭(zhēng)溫育后，在固相載體表面形成抗原-抗體-酶復(fù)合物。洗除多余部分，加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物發(fā)生降解反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)，通過(guò)酶標(biāo)檢測(cè)儀，測(cè)出酶底物的降解量，從而推知被測(cè)試樣中的抗原量。14.2 直接法二：基于競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫反應(yīng)，用甲醇/水振蕩提取粉碎樣品中的T-2毒素。處理后樣品中的T-2毒素與T-2毒素酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至包被在微孔板上的抗體。通過(guò)洗滌除去微孔上未結(jié)合的T-2毒素與T-2毒素酶標(biāo)記物，然后加入反應(yīng)底物，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，根據(jù)吸光度值得出試樣中的

17、T-2毒素含量。15 試劑和原料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。15.1 甲醇。15.2 石油醚。15.3 三氯甲烷。15.4 無(wú)水乙醇。15.5 乙酸乙酯。15.6 二甲基甲酰胺。15.7 四甲基聯(lián)苯胺（TMB）。15.8 吐溫-20。15.9 30%過(guò)氧化氫（30%H2O2）。15.10 抗T-2毒素單克隆抗體與辣根過(guò)氧化酶結(jié)合物。15.11 抗原：T-2毒素與載體蛋白-牛血清白蛋白的結(jié)合物（T-2-BSA）。15.12 ELISA緩沖液系統(tǒng)。15.12.1 包被緩沖液為pH9.6的碳酸鹽緩沖液，稱(chēng)取1.59g碳酸鈉（Na2CO3）、2.93g碳

18、酸氫鈉（NaHCO3），加水稀釋至1000mL。15.12.2 洗液為含0.05%吐溫-20的pH7.4的磷酸鹽緩沖液（簡(jiǎn)稱(chēng)PBS-T）。配制方法為：稱(chēng)取0.2g磷酸二氫鉀（KH2PO4）、2.9g磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）、8.0g氯化鈉（NaCl）、0.2g氯化鉀（KCl）、0.5mL吐溫-20，加水至1000mL。15.13 T-2毒素檢測(cè)試劑盒：包括包被有抗體的微孔條，T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)液，T-2毒素酶標(biāo)記物，T-2毒素抗體，底物，樣品稀釋液，反應(yīng)停止液。15.14 T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品：用乙腈作為溶劑配制制成200g/mL的儲(chǔ)備液，于-4條件下保存。15.15 樣品稀釋液：pH值

19、為7.2的磷酸鹽緩沖液（簡(jiǎn)稱(chēng)PBS）。配制方法為：分別稱(chēng)取0.55g磷酸二氫鈉（NaH2PO4H2O），2.85g磷酸氫二鈉（Na2HPO42H2O）和9g氯化鈉，用水溶解并定容至L。如果毒素含量較高，需要更高倍稀釋時(shí)（大于1：7），應(yīng)向此緩沖液中加入10% 的甲醇溶液，以保證甲醇溶液的濃度為10%。16 儀器和設(shè)備 所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡，用自來(lái)水、蒸餾水沖洗。16.1 酶標(biāo)檢測(cè)儀。16.2 酶標(biāo)板（40孔或96孔）。16.3 電動(dòng)振蕩器。16.4 電熱恒溫水浴鍋。16.5 具0.2mL尾管的10mL小濃縮瓶。16.6 天平：感量0.01g。16.7 均質(zhì)器。16.8 粉碎機(jī)。17 分

20、析步驟17.1 提取17.1.1 直接法一：稱(chēng)取20g粉碎并通過(guò)20目篩的試樣，置200mL具塞錐形燒瓶中，加8mL水和100mL三氯甲烷-無(wú)水乙醇（4+1），密塞，振蕩1h，通過(guò)濾紙過(guò)濾，取25mL濾液于蒸發(fā)皿中，置90水浴上通風(fēng)揮干。用50mL石油醚分次溶解蒸發(fā)皿中殘?jiān)?，洗?50mL分液漏斗中，再用20mL甲醇-水（4+1）分次洗滌，轉(zhuǎn)入同一分液漏斗中，振蕩1.5min，靜置約15min，收下層甲醇-水提取液過(guò)層析柱凈化（層析柱的：在層析柱下端與小管相連結(jié)處塞約0.1g脫脂棉，盡量塞緊，先裝入0.5g中性氧化鋁，敲平表面，再加入0.4g活性碳，敲緊）。將過(guò)柱后的洗脫液倒入蒸發(fā)皿中，并于水

21、浴鍋上濃縮至干，趁熱加3mL乙酸乙酯，加熱至沸，揮干，再重復(fù)一次，最后加3mL乙酸乙酯，冷至室溫后轉(zhuǎn)入濃縮瓶中。用適量乙酸乙酯洗滌蒸發(fā)皿，并入濃縮瓶中，將濃縮瓶置95水浴鍋上，揮干冷卻后，用含20%甲醇的PBS定容，供ELISA檢測(cè)之用。17.1.2 直接法二：將樣品按四分法縮分至1kg，全部磨碎至顆?？赏ㄟ^(guò)20目篩大小，混勻，均分成兩份作為試樣，分別裝入清潔的容器內(nèi)，密封，并標(biāo)明標(biāo)記。在抽樣和制樣的操作過(guò)程中，應(yīng)防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。稱(chēng)取25g試樣（精確到0.01g），加入125mL 甲醇-水（7+3），均質(zhì)1min2min，5000r/min離心10min。離心后取50L

22、 濾液加入300L 樣品稀釋液，混勻。取50L進(jìn)行酶聯(lián)免疫測(cè)定，最后稀釋倍數(shù)為35。高濃度的樣品，毒素含量如超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，可進(jìn)一步稀釋?zhuān)敝翗悠分卸舅貪舛仍跇?biāo)準(zhǔn)曲線范圍以?xún)?nèi)。17.2 ELISA檢測(cè)17.2.1 直接法一17.2.1.1 用T-2-BSA（4g/mL）包被酶標(biāo)板，每孔100L，4過(guò)夜。17.2.1.2 酶標(biāo)板用PBS-T洗3次，每次3min后，加入不同濃度的T-2標(biāo)準(zhǔn)溶液（制作標(biāo)準(zhǔn)曲線）或試樣提取液（檢測(cè)試樣中的毒素含量）與抗體-酶結(jié)合物溶液（1+100）的混合液（1+1，每孔100L，該混合液應(yīng)于使用前的前一天配好，4過(guò)夜備用），置37 1.5h。17.2.1.3 酶標(biāo)板

23、洗3次，每次3min后，加入底物溶液。每孔100L，37 30min。17.2.1.4 用1mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)，每孔50L，于450nm處測(cè)定吸光度值。17.2.2 直接法二17.2.2.1將測(cè)定需用的微孔條插入微孔架，記錄標(biāo)準(zhǔn)液和樣液在微孔架上的位置。吸取50L T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)液和樣液至各微孔。17.2.2.2吸取50L T-2毒素酶標(biāo)記物至各微孔，均勻混合，依次加入50L T-2毒素抗體，混合，以封口膜將微孔覆蓋防止試液揮發(fā)，于2225黑暗避光處孵育h。17.2.2.3倒出孔中液體，以250L 蒸餾水反復(fù)清洗微孔，重復(fù)操作3次以上，將微孔倒置在吸水紙上拍打數(shù)次，以保證完全除去微孔中洗液。17.2.2.4迅速加入100L 底物至各微孔，于2225黑暗避光處孵育30min。17.2.2.5孵育完畢后加入100L 反應(yīng)停止液至各微孔，充分混勻，上酶標(biāo)儀測(cè)量并記錄每個(gè)微孔試液450nm 波長(zhǎng)處的吸光度值（加入反應(yīng)終止液后應(yīng)在30min內(nèi)讀取吸光度）。標(biāo)準(zhǔn)校正曲線見(jiàn)圖A.2。18 結(jié)果計(jì)算18.1 直接法一：樣品中T-2毒素