分子腫瘤概論研究生學(xué)生全面版課件

1、1分子腫瘤概論研究生學(xué)生第1頁(yè)/共82頁(yè)1分子腫瘤概論研究生學(xué)生第1頁(yè)/共82頁(yè) 分子腫瘤概論一、有關(guān)腫瘤的基本概念（復(fù)習(xí)）腫瘤（tumor, neoplasm) 基因水平 調(diào)控失常 異常增生 新生物腫瘤生物學(xué)行為浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移能力 浸潤(rùn) (invasion)：起源處遷移 侵入周?chē)徑M織第1頁(yè)/共82頁(yè)第2頁(yè)/共82頁(yè) 分子腫瘤概論第1頁(yè)/共轉(zhuǎn)移(metastasis)：從原發(fā)部位血管、淋巴管、體腔它處繼續(xù)生長(zhǎng)與原發(fā)瘤同樣類(lèi)型腫瘤 （轉(zhuǎn)移瘤或繼發(fā)瘤） 第2頁(yè)/共82頁(yè)第3頁(yè)/共82頁(yè)第2頁(yè)/共82頁(yè)第3頁(yè)/共82頁(yè)轉(zhuǎn)移的途徑第3頁(yè)/共82頁(yè)第4頁(yè)/共82頁(yè)轉(zhuǎn)移的途徑第3頁(yè)/共82頁(yè)第4頁(yè)/共82

2、頁(yè)（2）Hematogenenous metastasis 全身臟器（3）Transcoelomic metastasis 體腔內(nèi)臟器脫落種植 （醫(yī)源性種植） 浸潤(rùn)生長(zhǎng)惡性腫瘤生長(zhǎng)的特點(diǎn) 腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程必經(jīng)的第一步第4頁(yè)/共82頁(yè)第5頁(yè)/共82頁(yè)（2）Hematogenenous metastasis第4腫瘤的組織結(jié)構(gòu) 實(shí)質(zhì) （parenchyma)間質(zhì) （mesenchyma, stroma) 腫瘤間質(zhì)的主要成分1. 血管 小血管 毛細(xì)血管 血竇樣 血管球樣 第5頁(yè)/共82頁(yè)第6頁(yè)/共82頁(yè)腫瘤的組織結(jié)構(gòu) 第5頁(yè)/共82頁(yè)第6頁(yè)/共82頁(yè)新的腫瘤血供模式血管生成擬態(tài)(vasculogenic

3、mimicry，VM)1999年， 學(xué)者M(jìn)aniotis等一種完全不同于經(jīng)典血管生成的微循環(huán)模式小管狀（似血管）管壁主要由基底膜(PAS陽(yáng)性)圍成，外襯以腫瘤細(xì)胞腔內(nèi)有血漿和紅細(xì)胞流動(dòng)管道與內(nèi)皮性血管相通多存在于高度惡性腫瘤第6頁(yè)/共82頁(yè)第7頁(yè)/共82頁(yè)新的腫瘤血供模式第6頁(yè)/共82頁(yè)第7頁(yè)/共82頁(yè)血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry） 腫瘤細(xì)胞構(gòu)成 有基底膜 小管狀（似血管） 與血管交通第7頁(yè)/共82頁(yè)第8頁(yè)/共82頁(yè)血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry）第72. 結(jié)締組織間質(zhì) （1）纖維和基質(zhì) 膠原纖維 常規(guī) HE 紅 特殊化學(xué)染色 VG 改良法 紅

4、 Masson 蘭色 構(gòu)成成分 I II III型膠原原纖維 又由相應(yīng)原纖維分子構(gòu)成 免疫組化或分子生物學(xué)方法可區(qū)別第8頁(yè)/共82頁(yè)第9頁(yè)/共82頁(yè)2. 結(jié)締組織間質(zhì)第8頁(yè)/共82頁(yè)第9頁(yè)/共82頁(yè)第9頁(yè)/共82頁(yè)第10頁(yè)/共82頁(yè)第9頁(yè)/共82頁(yè)第10頁(yè)/共82頁(yè)彈力纖維 常規(guī) HE淡紅色 特殊化學(xué)染色 Weigert或Verhceff暗蘭或黑色，彈力 酶消化后陰性 第10頁(yè)/共82頁(yè)第11頁(yè)/共82頁(yè)彈力纖維第10頁(yè)/共82頁(yè)第11頁(yè)/共82頁(yè)網(wǎng)狀纖維 銀染黑色，故也稱(chēng)嗜銀纖維。 PAS 強(qiáng)陽(yáng)性 第11頁(yè)/共82頁(yè)第12頁(yè)/共82頁(yè)網(wǎng)狀纖維第11頁(yè)/共82頁(yè)第12頁(yè)/共82頁(yè)成分 膠原蛋白

5、為主要成分 細(xì)胞間質(zhì)網(wǎng)狀纖維 型膠原蛋白 基底膜網(wǎng)狀纖維 型膠原蛋白和 層黏連蛋白（laminin）第12頁(yè)/共82頁(yè)第13頁(yè)/共82頁(yè)成分 膠原蛋白為主要成分 第12頁(yè)/共82頁(yè)第13頁(yè)/共8纖維黏連蛋白 Fibronectin（FN） 作用 A. 連接基質(zhì)中各種成分 B. 介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)成分與細(xì)胞表面連接黏蛋白 又稱(chēng)蛋白多糖（proteoglycan） 如透明質(zhì)酸，硫酸肝素等 骨黏素 （osteonectin） 第13頁(yè)/共82頁(yè)第14頁(yè)/共82頁(yè)纖維黏連蛋白 Fibronectin（FN）第13頁(yè)/共82（2）基底膜 (basement membrane , BM) 多種成分 與疾?。[

6、瘤浸潤(rùn)）關(guān)系密切 型膠原 不形成纖維，與、 型膠原不同 層黏連蛋白 （laminin ,LM） 有與細(xì)胞膜LM 受體相結(jié)合的位點(diǎn)第14頁(yè)/共82頁(yè)第15頁(yè)/共82頁(yè)（2）基底膜 (basement membrane , BM （3）細(xì)胞成分 固有的細(xì)胞成分 纖維母細(xì)胞和纖維細(xì)胞肌纖維母細(xì)胞 間充質(zhì)細(xì)胞 巨噬細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞 第15頁(yè)/共82頁(yè)第16頁(yè)/共82頁(yè) （3）細(xì)胞成分 第15頁(yè)/共82頁(yè)第16頁(yè)/共82頁(yè)反應(yīng)性細(xì)胞成分 各種細(xì)胞浸潤(rùn) 淋巴細(xì)胞 最常見(jiàn) 漿細(xì)胞 巨噬細(xì)胞 都屬免疫活性細(xì)胞 第16頁(yè)/共82頁(yè)第17頁(yè)/共82頁(yè)反應(yīng)性細(xì)胞成分第16頁(yè)/共82頁(yè)第17頁(yè)/共82頁(yè)二、腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)

7、移的分子機(jī)制（一）腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移 1.腫瘤細(xì)胞增殖和擴(kuò)展 浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的前提和基礎(chǔ) 2.腫瘤血管生成(tumor angiogenesis) 腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的必要條件第17頁(yè)/共82頁(yè)第18頁(yè)/共82頁(yè)二、腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制第17頁(yè)/共82頁(yè)第18頁(yè)/共83.腫瘤細(xì)胞分離脫落，與細(xì)胞外基質(zhì)黏附 （1）瘤細(xì)胞表面負(fù)電荷增加 （2）瘤細(xì)胞黏附力的改變 瘤細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)異常 瘤細(xì)胞同質(zhì)黏附力下降 指同種瘤細(xì)胞之間的黏附力第18頁(yè)/共82頁(yè)第19頁(yè)/共82頁(yè)3.腫瘤細(xì)胞分離脫落，與細(xì)胞外基質(zhì)黏附第18頁(yè)/共82頁(yè)第1瘤細(xì)胞異質(zhì)黏附力增加 指腫瘤細(xì)胞與其它不同細(xì)胞及間質(zhì)的黏附力同質(zhì)黏附力降低，有利于腫

8、瘤細(xì)胞分離；異質(zhì)黏附力的增加，有利于瘤細(xì)胞與基底膜、間質(zhì)成分粘附并穿過(guò)這些組織均由黏附分子介導(dǎo)通過(guò)配-受體之間的識(shí)別和結(jié)合實(shí)現(xiàn)第19頁(yè)/共82頁(yè)第20頁(yè)/共82頁(yè)第19頁(yè)/共82頁(yè)第20頁(yè)/共82頁(yè) （3）腫瘤黏附分子(adhesion molecules) 細(xì)胞表面結(jié)構(gòu) 鈣黏蛋白(cadherin) 又稱(chēng)為鈣連接素，鈣黏素。 依賴(lài)細(xì)胞外鈣 介導(dǎo)鈣離子依賴(lài)性細(xì)胞與細(xì)胞（同源細(xì)胞）的黏附 據(jù)分布不同 E-鈣黏蛋白 P-鈣黏蛋白 N-鈣黏蛋白 H-cad 第20頁(yè)/共82頁(yè)第21頁(yè)/共82頁(yè) （3）腫瘤黏附分子(adhesion molecules 整合素(integrin)細(xì)胞表面糖蛋白 ，約有

9、20 多個(gè)亞型 各種腫瘤細(xì)胞表面整合素種類(lèi)不同腫瘤生長(zhǎng)各個(gè)階段表達(dá)水平也不同 作用 a.介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附 b.參與不同細(xì)胞之間的黏附連接 C.扮演細(xì)胞信號(hào)傳遞的角色配體-整合素-細(xì)胞骨架蛋白跨膜信息傳導(dǎo)系統(tǒng)第21頁(yè)/共82頁(yè)第22頁(yè)/共82頁(yè) 整合素(integrin)第21頁(yè)/共82頁(yè)第22頁(yè)/共 免疫球蛋白超基因家族(immunoglobulin superfamily) 主要參與細(xì)胞與細(xì)胞間的連接 ICAM-1 （細(xì)胞間黏附分子-1） VCAM-1 （血管黏附因子） NCAM （神經(jīng)細(xì)胞黏附因子） 其它 包括CEA 、DCC第22頁(yè)/共82頁(yè)第23頁(yè)/共82頁(yè) 免疫球蛋白超基因

10、家族(immunoglobulin su選擇素(selectin) 內(nèi)源性植物凝血素（凝集素） 作用 介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、血小板與瘤細(xì)胞黏附 選擇素家族包括： P-selectin E-selectin L-selectin第23頁(yè)/共82頁(yè)第24頁(yè)/共82頁(yè)選擇素(selectin) 第23頁(yè)/共82頁(yè)第24頁(yè)/共 CD44 及其它 CD 44(透明質(zhì)酸受體) 介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附 路易斯寡糖（SLEX，,s-LewisX ） 血管內(nèi)皮細(xì)胞E-選擇素的配體 第24頁(yè)/共82頁(yè)第25頁(yè)/共82頁(yè) CD44 及其它 第24頁(yè)/共82頁(yè)第25頁(yè)/共82頁(yè)4.瘤細(xì)胞的遷移(migration)及化學(xué)趨

11、向性 (1)瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng) 黏附；肌動(dòng)蛋白、微管、中間絲 (2)瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)第25頁(yè)/共82頁(yè)第26頁(yè)/共82頁(yè)4.瘤細(xì)胞的遷移(migration)及化學(xué)趨向性第25頁(yè)/據(jù)其作用，大致可分為兩大類(lèi)：僅影響運(yùn)動(dòng)的因子 遷移刺激因子（MSF）既影響運(yùn)動(dòng)又影響生長(zhǎng)的因子 AMF (自分泌運(yùn)動(dòng)因子) HGF/SF（肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子/分散因子) 第26頁(yè)/共82頁(yè)第27頁(yè)/共82頁(yè)據(jù)其作用，大致可分為兩大類(lèi)：第26頁(yè)/共82頁(yè)第27頁(yè)/共8(3)瘤細(xì)胞的化學(xué)趨向性 21KD 的蛋白質(zhì) 骨吸收因子 第27頁(yè)/共82頁(yè)第28頁(yè)/共82頁(yè)(3)瘤細(xì)胞的化學(xué)趨向性第27頁(yè)/共82頁(yè)第28頁(yè)/共82頁(yè)5.細(xì)胞外

12、基質(zhì)的降解(1)腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞外基質(zhì)的步驟 Liotta 1986年提出 第一步 黏附于基底膜或其他間質(zhì)成分 第二步 分泌蛋白酶并激活, 降解瘤細(xì)胞 鄰近的細(xì)胞外基質(zhì) 第三步 進(jìn)入受蛋白酶降解的基質(zhì)區(qū)域內(nèi) 第28頁(yè)/共82頁(yè)第29頁(yè)/共82頁(yè)5.細(xì)胞外基質(zhì)的降解第28頁(yè)/共82頁(yè)第29頁(yè)/共82頁(yè)(2)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白水解酶絲氨酸蛋白酶類(lèi)及其抑制因子纖維蛋白溶解酶(纖溶酶) 纖溶酶原 a. 降解基質(zhì) 如纖維蛋白，F(xiàn)N, LM, 蛋白多糖 b. 激活膠原酶 膠原降解第29頁(yè)/共82頁(yè)第30頁(yè)/共82頁(yè)(2)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白水解酶第29頁(yè)/共82頁(yè)第30頁(yè)/共尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokin

13、ase-type plasminogen activator , u-PA）系統(tǒng) Au-PA： 介導(dǎo)細(xì)胞周?chē)|(zhì)蛋白的降解Bu-PA 受體（u-PAR）及纖溶酶原受體 活化u-PA 原酶形式的u-PA纖溶酶原+纖溶酶原受體 纖溶酶第30頁(yè)/共82頁(yè)第31頁(yè)/共82頁(yè)尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-type plaCPAI （PA 抑制劑） PAI1 是u-PA 的主要抑制劑 PAI2 不同腫瘤表達(dá)意義不一 PAI3 功能不清第31頁(yè)/共82頁(yè)第32頁(yè)/共82頁(yè)CPAI （PA 抑制劑）第31頁(yè)/共82頁(yè)第32頁(yè)/共8基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases

14、, MMP）及其抑制因子 需鈣、鋅離子作輔助因子 MMP 分類(lèi) 膠原酶：如間質(zhì)膠原酶 （Collagenase） 明膠酶：如明膠酶A (gelatinase A) 間質(zhì)溶素：如間質(zhì)溶素1 、2 膜型基質(zhì)金屬蛋白酶：、型 第32頁(yè)/共82頁(yè)第33頁(yè)/共82頁(yè)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloprotein可分別降解ECM中各種不同成分 ECM降解的主要蛋白水解酶類(lèi)金屬蛋白酶抑制物 TIMP-1 ，TIMP-2 浸潤(rùn)與否取決于MMP與TIMP的對(duì)比 MMPTIMP ECM降解才能成為可能第33頁(yè)/共82頁(yè)第34頁(yè)/共82頁(yè)可分別降解ECM中各種不同成分第33頁(yè)/共82頁(yè)第34頁(yè)/共胱氨酸

15、蛋白酶類(lèi) Cathepsin B 作用 降解ECM中各種膠原、LM、 FN、黏蛋白 激活間質(zhì)膠原酶和IV型膠原酶天（門(mén)）冬氨酸蛋白酶 cathepsin D, E 在腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用 CD 表達(dá)的調(diào)節(jié)第34頁(yè)/共82頁(yè)第35頁(yè)/共82頁(yè)胱氨酸蛋白酶類(lèi) 第34頁(yè)/共82頁(yè)第35頁(yè)/共82頁(yè)6.瘤細(xì)胞以主動(dòng)方式入循環(huán)管道并形成栓子 微小淋巴管、微小靜脈壁 縫隙 血管 基底膜缺損 瘤細(xì)胞存在形式 單個(gè) 成團(tuán) 同類(lèi)癌栓 異類(lèi)癌栓 黏附分子對(duì)其發(fā)揮調(diào)節(jié)作用 第35頁(yè)/共82頁(yè)第36頁(yè)/共82頁(yè)6.瘤細(xì)胞以主動(dòng)方式入循環(huán)管道并形成栓子第35頁(yè)/共82頁(yè)第7.在特定器官的毛細(xì)血管滯留并黏著，再次穿過(guò)血管

16、壁并定居、增殖 器官特異性（選擇性）機(jī)制 (1) 黏附分子的作用 (2) 化學(xué)趨化因子（歸巢現(xiàn)象) (3) 微環(huán)境不適合 (4) 與免疫狀態(tài)有關(guān)第36頁(yè)/共82頁(yè)第37頁(yè)/共82頁(yè)7.在特定器官的毛細(xì)血管滯留并黏著，再次穿過(guò)血管壁并定居、增 （二）機(jī)體免疫狀態(tài)與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移 參與控制轉(zhuǎn)移的免疫細(xì)胞主要有 NK 細(xì)胞 巨噬細(xì)胞 T 淋巴細(xì)胞 （三）腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因 轉(zhuǎn)移相關(guān)基因指基因的表達(dá)和改變能夠促進(jìn)或?qū)е履[瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的基因 第37頁(yè)/共82頁(yè)第38頁(yè)/共82頁(yè) （二）機(jī)體免疫狀態(tài)與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移第37頁(yè)/共82頁(yè)第38頁(yè)（四）腫瘤表觀遺傳改變與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移表觀遺傳學(xué)(Epigenetics

17、) 與遺傳學(xué)(genetic)相對(duì)應(yīng)的概念表型狀態(tài)改變，基因型不改變 沒(méi)有DNA序列變化的情況下， 可遺傳的基因表達(dá)改變，導(dǎo)致的基因產(chǎn)物的變化。 1942年提出，上世紀(jì)80年代后期逐漸興起的一門(mén)新學(xué)科 第38頁(yè)/共82頁(yè)第39頁(yè)/共82頁(yè)（四）腫瘤表觀遺傳改變與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移第38頁(yè)/共82頁(yè)第39DNA的“后天性”修飾 CpG島高甲基化 癌細(xì)胞基因組低甲基化組蛋白殘基的各種修飾 磷酸化 乙?；?甲基化 泛素化等等 第39頁(yè)/共82頁(yè)第40頁(yè)/共82頁(yè)DNA的“后天性”修飾 第39頁(yè)/共82頁(yè)第40頁(yè)/共82頁(yè)（五）腫瘤干細(xì)胞(tumor stem cell, TSC) 2001年由Reya等提

18、出 2006年 癌癥研究協(xié)會(huì)（AACR）定義 存在于腫瘤組織中具有無(wú)限自我更新能力并能產(chǎn)生不同分化程度的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞 第40頁(yè)/共82頁(yè)第41頁(yè)/共82頁(yè)（五）腫瘤干細(xì)胞(tumor stem cell, TSC) 特征 (1) 無(wú)限增殖和多向分化 (2)存在自我更新的信號(hào)傳導(dǎo)途徑 (3)具不同表型，異質(zhì)性，對(duì)放化療不敏感 (4)具有端粒酶活性 (5)能轉(zhuǎn)移到各種不同的組織 第41頁(yè)/共82頁(yè)第42頁(yè)/共82頁(yè) 特征 第41頁(yè)/共82頁(yè)第42頁(yè)/共82頁(yè)（六）腫瘤微環(huán)境與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移 腫瘤細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞 細(xì)胞外基質(zhì)間質(zhì)細(xì)胞所分泌的活性介質(zhì)（細(xì)胞因子） 共同構(gòu)成的局部?jī)?nèi)環(huán)境 第42頁(yè)/共82頁(yè)第

19、43頁(yè)/共82頁(yè)（六）腫瘤微環(huán)境與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移 第42頁(yè)/共82頁(yè)第43頁(yè)/微環(huán)境改變腫瘤細(xì)胞自分泌和旁分泌 全身和局部組織代謝、分泌、免疫 結(jié)果： 限制或促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展 第43頁(yè)/共82頁(yè)第44頁(yè)/共82頁(yè)微環(huán)境改變第43頁(yè)/共82頁(yè)第44頁(yè)/共82頁(yè) 第44頁(yè)/共82頁(yè)第45頁(yè)/共82頁(yè) 第44頁(yè)/共82頁(yè)第45頁(yè)/共82頁(yè)三.腫瘤學(xué)研究中常用的分子生物學(xué)基本技術(shù)及其應(yīng)用(一)蛋白表達(dá)異常的檢測(cè)免疫組化（熒光）定位 ELISA和Western blot 、流式細(xì)胞術(shù)定量 抗體標(biāo)記抗原標(biāo)記抗體細(xì)胞細(xì)胞抗體標(biāo)記抗原標(biāo)記細(xì)胞第45頁(yè)/共82頁(yè)第46頁(yè)/共82頁(yè)三.腫瘤學(xué)研究中常用的分子生物

20、學(xué)基本技術(shù)及其應(yīng)用 抗體標(biāo)記抗（二）蛋白質(zhì)相互作用的檢測(cè)方法1.酵母雙雜交法 驗(yàn)證兩個(gè)已知蛋白的相互作用 篩選與已知蛋白作用的未知蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白-蛋白間相互作用的有效和快速的方法，第46頁(yè)/共82頁(yè)第47頁(yè)/共82頁(yè)（二）蛋白質(zhì)相互作用的檢測(cè)方法第46頁(yè)/共82頁(yè)第47頁(yè)/共酵母雙雜交的原理是將2個(gè)目的蛋白分別與轉(zhuǎn)錄激活區(qū)（transcription activation domain，AD）和DNA 結(jié)合區(qū)（DNA-binding domain，DBD）融合產(chǎn)生新的融合蛋白，如果這2個(gè)目的蛋白能夠互相作用，則該相互作用會(huì)促使AD和DBD 互相靠近而產(chǎn)生有活性的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而激活

21、事先構(gòu)建到酵母基因組中的報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。（真核轉(zhuǎn)錄因子DBD能把蛋白定位到基因組特定DNA序列上，AD能夠使轉(zhuǎn)錄裝置激活基因轉(zhuǎn)錄。當(dāng)這兩個(gè)區(qū)域單獨(dú)存在時(shí)均沒(méi)有轉(zhuǎn)錄激活功能，但當(dāng)它們?cè)诳臻g上彼此聯(lián)系時(shí)，則能夠激活基因轉(zhuǎn)錄。） 第47頁(yè)/共82頁(yè)第48頁(yè)/共82頁(yè)酵母雙雜交的原理是將2個(gè)目的蛋白分別與轉(zhuǎn)錄激活區(qū)（trans局限性 雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi) 酵母雙雜交系統(tǒng)的一個(gè)重要的問(wèn)題是“假陽(yáng)性” 第48頁(yè)/共82頁(yè)第49頁(yè)/共82頁(yè)局限性 第48頁(yè)/共82頁(yè)第49頁(yè)/共82頁(yè)2.免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP）是以抗體和抗原之間的專(zhuān)一性作

22、用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的常用、經(jīng)典方法。其基本原理是:細(xì)胞裂解液中加入抗體，與抗原形成特異免疫復(fù)合物，經(jīng)過(guò)洗脫，收集免疫復(fù)合物，然后進(jìn)行SDS及Western blotting分析。 第49頁(yè)/共82頁(yè)第50頁(yè)/共82頁(yè)2.免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation1999年， 學(xué)者M(jìn)aniotis等酵母雙雜交的原理是將2個(gè)目的蛋白分別與轉(zhuǎn)錄激活區(qū)（transcription activation domain，AD）和DNA 結(jié)合區(qū)（DNA-binding domain，DBD）融合產(chǎn)生新的融合蛋白，如果這2個(gè)目的蛋白能夠互相作用，則該相互作用會(huì)促使AD和DBD 互相

23、靠近而產(chǎn)生有活性的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而激活事先構(gòu)建到酵母基因組中的報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附核酸雜交技術(shù)與PCR技術(shù)(3)瘤細(xì)胞的化學(xué)趨向性各種細(xì)胞浸潤(rùn)E-selectin堿基序列不同的單鏈DNA構(gòu)像改變固有的細(xì)胞成分間充質(zhì)細(xì)胞微小淋巴管、微小靜脈壁 縫隙小血管 毛細(xì)血管 血竇樣 血管球樣降解基質(zhì) 如纖維蛋白，F(xiàn)N, LM, 蛋白多糖（醫(yī)源性種植）纖維蛋白溶解酶(纖溶酶)骨黏素 （osteonectin）ICAM-1 （細(xì)胞間黏附分子-1）缺點(diǎn)免疫沉淀蛋白有可能不是直接相互作用的蛋白，而是通過(guò)第三者間接相互作用的蛋白靈敏度不及蛋白親和色譜高必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)

24、的抗體，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性假陽(yáng)性的概率比較高第50頁(yè)/共82頁(yè)第51頁(yè)/共82頁(yè)1999年， 學(xué)者M(jìn)aniotis等缺點(diǎn)第50頁(yè)/共82頁(yè)設(shè)置的對(duì)照包括：在對(duì)照組中使用對(duì)照抗體，以缺失目的蛋白的細(xì)胞系作為陰性對(duì)照等等。 第51頁(yè)/共82頁(yè)第52頁(yè)/共82頁(yè)設(shè)置的對(duì)照包括：第51頁(yè)/共82頁(yè)第52頁(yè)/共82頁(yè)沉淀實(shí)驗(yàn)（GST-pull down實(shí)驗(yàn)）主要是用來(lái)證明細(xì)胞外蛋白質(zhì)相互作用利用GST (Glutathione-S-transferase， GST)和谷胱甘肽親和樹(shù)脂之間的高親和性將GST固化在樹(shù)脂上GST和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶蛋白在細(xì)菌、動(dòng)物細(xì)胞等體系中融合表

25、達(dá)固化的誘餌蛋白【即誘餌蛋白(Bait protein)】可以捕獲細(xì)胞裂解物中的互作用靶蛋白洗脫結(jié)合物后通過(guò)western blot 檢測(cè)誘餌蛋白和靶蛋白,從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白 第52頁(yè)/共82頁(yè)第53頁(yè)/共82頁(yè)沉淀實(shí)驗(yàn)（GST-pull down實(shí)驗(yàn)）第52頁(yè)/共82頁(yè)第53頁(yè)/共82頁(yè)第54頁(yè)/共82頁(yè)第53頁(yè)/共82頁(yè)第54頁(yè)/共82頁(yè)4.Far-Western blotting在經(jīng)典Far-Western印跡中，運(yùn)用經(jīng)標(biāo)記的或可被抗體檢測(cè)的“誘餌”蛋白檢測(cè)轉(zhuǎn)移膜上的“獵物”靶蛋白。用SDS或非變性PAGE分離含有未知靶蛋白的樣品（通常為細(xì)菌裂解液）然后轉(zhuǎn)膜

26、。轉(zhuǎn)膜后與已知誘餌蛋白孵育，運(yùn)用該誘餌蛋白的特異性檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)。（出相應(yīng)條帶+）5.生物信息學(xué)第54頁(yè)/共82頁(yè)第55頁(yè)/共82頁(yè)4.Far-Western blotting第54頁(yè)/共82（三）基因拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA異常 核酸分子生物學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)核酸變性、復(fù)性基本性質(zhì)常用方法 第55頁(yè)/共82頁(yè)第56頁(yè)/共82頁(yè)（三）基因拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA異常第55頁(yè)/共82頁(yè)第51. 核酸分子雜交（nucleic acid molecular hybridisation）技術(shù)最常用的基本技術(shù)基本原理： -標(biāo)記的已知堿基序列（DNA或RNA單鏈片段）（探針probe ） （同位素P32 I12

27、5 非同位素 生物素 地高辛 熒光素） -檢測(cè)靶核酸（待測(cè)核酸）中是否存在與之 同源的序列 第56頁(yè)/共82頁(yè)第57頁(yè)/共82頁(yè)1. 核酸分子雜交（nucleic acid molecul（1）原位雜交 （ISH）（2）熒光原位雜交 （FISH），（3）雙色（多色）銀染原位雜交（DSISH）（4）Southern blot (DNA 雜交)（5）Northern blot (RNA 雜交)第57頁(yè)/共82頁(yè)第58頁(yè)/共82頁(yè)（1）原位雜交 （ISH）第57頁(yè)/共82頁(yè)第58頁(yè)/共82第58頁(yè)/共82頁(yè)第59頁(yè)/共82頁(yè)第58頁(yè)/共82頁(yè)第59頁(yè)/共82頁(yè)2. 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase

28、 chain reaction , PCR）技術(shù) 又稱(chēng)體外基因擴(kuò)增利用DNA變性和復(fù)性原理體外進(jìn)行特定的DNA 片段高效擴(kuò)增 獲得或放大特異基因信號(hào)的重要手段第59頁(yè)/共82頁(yè)第60頁(yè)/共82頁(yè)2. 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain rea擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 凝膠電泳分析 瓊脂糖凝膠電泳 (最常用) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 單一條帶第60頁(yè)/共82頁(yè)第61頁(yè)/共82頁(yè)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 凝膠電泳分析 第60頁(yè)/共82頁(yè)第61頁(yè) Real-time PCR RT-PCR3.基因芯片技術(shù)第61頁(yè)/共82頁(yè)第62頁(yè)/共82頁(yè) Real-time PCR第61頁(yè)/共82頁(yè)第62頁(yè)/共8(四)基因突變

29、的檢測(cè)方法1.聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（Single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products , PCR-SSCP）長(zhǎng)度相同，構(gòu)象不同在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳遷移率（泳動(dòng)率）不同堿基序列不同的單鏈DNA構(gòu)像改變第62頁(yè)/共82頁(yè)第63頁(yè)/共82頁(yè)(四)基因突變的檢測(cè)方法第62頁(yè)/共82頁(yè)第63頁(yè)/共82頁(yè)基本方法 作PCR 將產(chǎn)物變性而成為單鏈 進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 顯示結(jié)果 可用同位素/熒光素標(biāo)記 非同位素標(biāo)記 第63頁(yè)/共82頁(yè)第64頁(yè)/共82頁(yè)基本方

30、法第63頁(yè)/共82頁(yè)第64頁(yè)/共82頁(yè)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restrection fragment length polymorphisms , RFLP）分析技術(shù)基本原理 -序列中一個(gè)堿基發(fā)生改變 -使原來(lái)的內(nèi)切酶位點(diǎn)消失或產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)-用限制性?xún)?nèi)切酶消化PCR擴(kuò)增出來(lái)的DNA片段 -檢測(cè)其酶切片段長(zhǎng)度的差異第64頁(yè)/共82頁(yè)第65頁(yè)/共82頁(yè)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restrection fragmen3.變性梯度凝膠電泳法（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)基本原理 電泳時(shí)，不同濃度凝膠溫度不同 DNA鏈中有一個(gè)堿基改變 在不

31、同的溫度發(fā)生解鏈 電泳遷移率改變 第65頁(yè)/共82頁(yè)第66頁(yè)/共82頁(yè)3.變性梯度凝膠電泳法（denaturing gradien 4. DNA 序列分析（DNA sequencing ） 5. 熒光原位雜交 ( FISH) 6 DNA 芯片技術(shù)（DNA chip ）第66頁(yè)/共82頁(yè)第67頁(yè)/共82頁(yè) 4. DNA 序列分析（DNA sequencing ）第（五）腫瘤的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性分析微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability , MI）, 是指簡(jiǎn)單重復(fù)序列的增加或丟失 PCR + DNA 序列凝膠電泳（六）腫瘤易感性檢測(cè) 采用相應(yīng)基因變異方法進(jìn)行檢測(cè)（七）腫瘤

32、相關(guān)病毒 核酸雜交技術(shù)與PCR技術(shù) (八) 基因重組技術(shù) 主要目的是獲得某一基因或DNA片段的大 量拷貝 (九) 基因轉(zhuǎn)染（gene transfection）技術(shù)（十）RNA干涉(RNA interference）第67頁(yè)/共82頁(yè)第68頁(yè)/共82頁(yè)（五）腫瘤的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性分析第67頁(yè)/共82頁(yè)第68頁(yè)/共核酸雜交/PCR技術(shù)與蛋白表達(dá)【免疫組化/熒光、流式細(xì)胞術(shù)、WB方法結(jié)合、蛋白結(jié)合檢測(cè)方法 】蛋白表達(dá) 在翻譯水平上定位研究基因表達(dá) 核酸雜交/PCR技術(shù) 檢測(cè)DNA/RNA， 在基因或轉(zhuǎn)錄水平研究基因表達(dá) 第68頁(yè)/共82頁(yè)第69頁(yè)/共82頁(yè)核酸雜交/PCR技術(shù)與蛋白表達(dá)【免疫組化/熒

33、光、流式細(xì)胞術(shù)、（十一）DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合檢測(cè)1.凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（Gel retardation assay）DNA遷移率變動(dòng)試驗(yàn)（DNA mobility shift assay）或條帶阻滯實(shí)驗(yàn)（Band retardation assay） 第69頁(yè)/共82頁(yè)第70頁(yè)/共82頁(yè)（十一）DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合檢測(cè)第69頁(yè)/共82頁(yè)第70頁(yè)/共基本 原理： 在非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳 中， D N A和蛋白質(zhì)的復(fù)合物的遷移速度比單一的 D N A片段或雙鏈的寡核苷酸慢 反應(yīng)產(chǎn)物 電泳分析D N A與蛋 白質(zhì)結(jié)合的特異性通過(guò)非標(biāo)記D N A競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)來(lái)確定第70頁(yè)/共82頁(yè)第71頁(yè)/共82頁(yè)基本 原

34、理：第70頁(yè)/共82頁(yè)第71頁(yè)/共82頁(yè)2.足跡實(shí)驗(yàn)（foot-printing assay）原理：當(dāng)DNA分子中的某一區(qū)段同特異的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合之后便可以得到保護(hù)而免受DNaseI 酶的切割,而不產(chǎn)生出相應(yīng)的切割分子, 在凝膠電泳放射性自顯影圖片上便出現(xiàn)了一個(gè)空白區(qū),俗稱(chēng)為“足跡”. 第71頁(yè)/共82頁(yè)第72頁(yè)/共82頁(yè)2.足跡實(shí)驗(yàn)（foot-printing assay）第71（2）熒光原位雜交 （FISH），據(jù)分布不同 E-鈣黏蛋白NCAM （神經(jīng)細(xì)胞黏附因子）Far-Western blotting瘤細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)異常在腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用轉(zhuǎn)移相關(guān)基因與疾病（腫瘤浸潤(rùn)）關(guān)系密切免疫組化（熒光）定位（3）腫瘤黏附分子(adhesion molecules)3.染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù) （chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）基本原理：在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物,并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段,然后通過(guò)免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體,特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段第72頁(yè)/共82頁(yè)第73頁(yè)/共