貴州野生天麻遺傳多樣性的AFLP指紋分析

1、貴州野生天麻遺傳多樣性的AFLP指紋分析【摘要】目的研究野生天麻的遺傳多樣性，為合理利用野生天麻種質(zhì)資源、為天麻的進(jìn)一步系統(tǒng)選育研究提供一定的理論根據(jù)。方法利用AFLP技術(shù)，采用8對(duì)+3和P+3引物組合對(duì)23份貴州野生天麻品種進(jìn)展了總基因組DNA程度上的多態(tài)性檢測(cè)，用NTSYSp-2.10s軟件的UPGA方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)展聚類。結(jié)果共獲得552條可統(tǒng)計(jì)的條帶，其中396條呈多態(tài)性，多態(tài)性帶百分率約72%。UPGA聚類可以將貴州不同產(chǎn)地的野生天麻很好地區(qū)分開來。結(jié)論該實(shí)驗(yàn)提醒了貴州野生天麻種質(zhì)豐富的遺傳多樣性，聚類分析結(jié)果說明多數(shù)來源地一樣的天麻種質(zhì)表現(xiàn)出較為親密的親緣關(guān)系?！娟P(guān)鍵詞】野生天麻；

2、遺傳多樣性；AFLPAbstrat：bjetiveTstudythegenetiplyrphisfildGastrdiaelataBl.inGuizhuprvine,andprvidereferenefrtheutilizingitsgerplasresuresandultivatingnevarieties.ethdsThephylgentirelatinshipsang23ildGastrdiaelataBl.inGuizhuereanalyzedusingAFLPtstudythegenetidiversityithEightAFLPprierbinatins(+3andP+3).The

3、deterinedleulararkersereanalyzedthrughUPGAethdfsftareNTSYSp-2.10s.Results552bandseredeteted，396fhihereplyrphi,andthehighratifplyrphibands(86%)erebservedinthisstudy.ThedendrgrafrthelusteringfUPGAshedgdlassifiatinfallppulatin.nlusinurresultssuggestthatildGastrdiaelataBl.inGuizhushsabundantgenetidivers

4、ities.ResultsflusteranalysisshedthatthelassifiatinbasednAFLParkersfildGastrdiaelataBl.inGuizhuisnsistentiththEIrrigin.Keyrds：ildGastrdiaelataBl.；Genetiplyrphis；AFLP天麻為蘭科(rehidaeae)多年生草本植物天麻GastrdiaelataBl.的枯燥根莖，為我國傳統(tǒng)名貴中藥。其主要有效成分天麻素具有廣泛的藥理作用,具有鎮(zhèn)靜催眠、抗驚厥、增智、健腦、治療老年性癡呆癥、抗氧化、延緩衰老、增強(qiáng)免疫功能、調(diào)節(jié)心血管等作用。就天麻遺傳學(xué)研究

5、來看，傳統(tǒng)的研究主要是從形態(tài)學(xué)方面進(jìn)展研究。近年來研究主要是運(yùn)用RAPD1,2，AFLP2，ISSR3等分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其遺傳進(jìn)化、品種分類鑒定等方面進(jìn)展研究。野生天麻作為一種重要的遺傳種質(zhì)資源，未見有對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)展研究的報(bào)道。本研究利用AFLP技術(shù),以8對(duì)引物對(duì)23株不同來源的貴州野生天麻基因組DNA進(jìn)展分析,旨在從分子程度上認(rèn)識(shí)貴州天麻野生資源的遺傳多樣性和其遺傳親緣關(guān)系,為天麻種質(zhì)資源的搜集保存和有效利用提供理論根據(jù)。1儀器與材料1.1材料樣品采自貴州不同地區(qū)或一樣地區(qū)的不同居群，均為野生未受人為干擾狀態(tài)下生長，詳細(xì)類型和分布見表1；所有樣品經(jīng)貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥學(xué)教研室王曉麗教授鑒

6、定。表1樣品編號(hào)分類及產(chǎn)地略1.2儀器與試劑試驗(yàn)中用se、Pst、ER、T4DNAlingase、RNA酶試劑來自NEB公司，丙烯酰胺SIGA、聚丙烯酰胺SIGA，接頭和引物由上海生工生物公司合成，Taq酶、dNTP來自大連寶生物公司。DY2-20型電泳槽、DYY-12型電泳儀北京市六一儀器廠，PR儀TEHGENE,其余為國產(chǎn)分析純?cè)噭?方法2.1基因組DNA制備47新穎采集的天麻塊莖或地上莖切成小塊后用改良的TAB法提取基因組DNA，用0.8的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，并用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定DNA濃度，將樣品用pH8.0TE稀釋后-20冰箱保存?zhèn)溆谩?.2AFLP分析8，92.2.1天

7、麻基因組DNA的酶切與連接取參加45l如下的酶切連接混和液：ddH237.85l；10NEB2.5l；se接頭(50pll-1)1l；Pst或ER接頭5pll-11l；10ATP1l；5l濃度為100200ngl-1天麻基因組DNA；T4DNAlingase5Ul-10.4l；se10Ul-10.5l；Pst或ER(10Ul-1)0.5l。37保溫過夜后取5l酶切連接產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。2.2.2預(yù)擴(kuò)增預(yù)擴(kuò)增PR反響體系20l為：ddH210l；10buffer2l；dNTP(2)2l；g2+(20)1.5l；Taq酶(2Ul-1)0.5l；酶切連接產(chǎn)物2l；引物00(50ng

8、l-1)1l；引物P00或E00(50ngl-1)1l。預(yù)擴(kuò)增PR反響程序?yàn)椋?5.05in95.035s56.035s72.01inGTSTEP230yles72.05in4.0保溫。反響完畢后取5l預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。剩余的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物用TE(pH8.0)溶液稀釋20倍后于-20保存，以待選擇性擴(kuò)增用。2.2.3選擇性擴(kuò)增選擇性擴(kuò)增PR反響體系20l為：ddH27l；10buffer2l；dNTP(2)2l；g2+(20)1.5l；Taq酶(2Ul-1)0.5l；稀釋20倍的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物5l；引物(50ngl-1)1l；P或E引物(50ngl-1)1l。選擇性擴(kuò)增PR反響

9、程序?yàn)椋?5.05in95.040s65.0每循環(huán)降低0.740s72.01inGTSTEP213yles95.040s56.040s72.01inGTSTEP624yles72.05in4.0保溫。選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物與7l的LadingBuffer混和，95變性5in，立即轉(zhuǎn)移至冰浴冷卻，待用。2.2.4選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，先安裝好垂直電泳槽然后灌入1TBE電泳液，排除點(diǎn)樣孔氣泡，2500V恒壓預(yù)電泳40in。預(yù)電泳后將7l變性后的選擴(kuò)產(chǎn)物上樣于點(diǎn)樣孔內(nèi)，2500V恒壓電泳至第一條指示劑條帶跑至膠板底邊時(shí)停頓，電泳時(shí)間約23h。然后銀染顯帶3。2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)

10、計(jì)與分析AFLP電泳圖譜用GelPrAnalyzerVersin410分析,只記錄那些可識(shí)別的、兩次擴(kuò)增結(jié)果一致的條帶，同一位點(diǎn)有帶記為“1,無帶記為“0，形成0/1矩陣圖輸入計(jì)算機(jī)，采用NTSYSp-2.10s軟件的UPGA方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)展聚類，計(jì)算出天麻各樣品的遺傳相似度。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3結(jié)果3.1天麻基因組DNA圖譜結(jié)果見圖1。3.2AFLP結(jié)果分析利用從30對(duì)引物中挑選出的8對(duì)AFLP引物對(duì)23份野生天麻種質(zhì)的基因組DNA進(jìn)展片段長度多態(tài)性擴(kuò)增，獲得了較好的擴(kuò)增結(jié)果見表2。共擴(kuò)增出552條譜帶100700bp，其中396條具有多態(tài)性，占72%，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出69條可統(tǒng)計(jì)的

11、帶，其中50條具有多態(tài)性?？梢?，AFLP檢測(cè)野生天麻種質(zhì)資源遺傳多樣性的效率很高，也充分表達(dá)了野生天麻的遺傳多樣性。結(jié)果見圖2。表28對(duì)AFLP選擇性擴(kuò)增引物產(chǎn)生的條帶多態(tài)性略3.3遺傳間隔 和聚類分析結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，23株野生天麻種質(zhì)兩兩間的相似系數(shù)分布在0.570.85之間，其中21號(hào)與23號(hào)的相似系數(shù)最小，為0.584，說明2種質(zhì)間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。2號(hào)與3號(hào)、12號(hào)與13號(hào)、19號(hào)與20號(hào)的相似系數(shù)最大，為0.85，說明這6個(gè)種質(zhì)兩兩間的親緣關(guān)系最近。以相似系數(shù)0.57為標(biāo)準(zhǔn)，23株野生天麻種質(zhì)可分為A、B兩大聚類群，其中紅麻和烏麻聚在一起，黃麻和綠麻聚在一起。A聚類群在相似

12、系數(shù)0.58附近又分為2個(gè)亞類：第1亞類包括18株，在相似系數(shù)0.66附近又分為兩組，第1組有13株，全部為來自不同產(chǎn)地的烏麻，第2組5株全部為來自不同產(chǎn)地的紅麻。說明野生天麻種間變異度比擬校從圖3還可以看出多數(shù)來源地一樣的種質(zhì)表現(xiàn)出較為親密的親緣關(guān)系，比方來自遵義地區(qū)的1、2、3、號(hào)聚在一起，來自德江的19、20號(hào)聚在一起等。但也有同一來源地的品種未聚在一起的情況，比方來自遵義的1、2、3、4、5、6號(hào)沒有完全聚在一起。說明同一品種一樣地區(qū)的種間變異度比擬大。第2亞類只有1株，為烏麻品種。B聚類群包括4株，該類包含兩個(gè)品種黃麻和綠麻，其中7號(hào)綠麻與10號(hào)和11號(hào)黃麻先聚在一起，再與21號(hào)綠麻

13、聚合；7號(hào)和21號(hào)同為綠麻，但是并沒有聚在一起，可能是因?yàn)楫a(chǎn)地相距較遠(yuǎn)。4討論本試驗(yàn)利用AFLP方法分析了23份野生天麻的遺傳差異，獲得了約72%的多態(tài)性位點(diǎn)。鄒佳寧等1利用RAPD研究天麻種質(zhì)的遺傳關(guān)系，獲得70.97%的多態(tài)性位點(diǎn)，與我們得到的結(jié)果略有差異。這可能是由于AFLP在擴(kuò)增出豐富的多態(tài)性帶的同時(shí)也擴(kuò)增出了大量的單態(tài)性帶，使得其多態(tài)性帶的百分率并沒有明顯進(jìn)步。但平均每對(duì)引物所產(chǎn)生的多態(tài)性帶數(shù)69條明顯高于前者的7.75條。由此可見，AFLP標(biāo)記顯然是快速、高效的分子標(biāo)記。此外，從DNA分子程度上來說，遺傳多樣性越高，說明其遺傳背景越復(fù)雜，該物種存在的歷史越長遠(yuǎn)。約72%的多態(tài)性，說

14、明野生天麻在其遺傳進(jìn)化過程中，基因組DNA發(fā)生了豐富的變異。同時(shí)也提醒了野生天麻種質(zhì)資源極其豐富的遺傳多樣性。一個(gè)物種的進(jìn)化潛力和抵御逆境的才能取決于種內(nèi)遺傳變異的大小，遺傳多樣性越豐富，對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)才能越強(qiáng)，其自然分布范圍越廣。聚類圖中兩大群中大局部同一變型、同一來源地的天麻優(yōu)先聚合，表現(xiàn)出較為親密的親緣關(guān)系。這與天麻野生種源生態(tài)條件與生態(tài)習(xí)性等綜合因素有關(guān)。但也有同一來源地的品種未聚在一起的情況，這種現(xiàn)象可能是AFLP方可反映基因組本質(zhì)的差異所致。在第一大類中，紅麻和烏麻先聚在一起，再與不同產(chǎn)地的烏麻聚為一大類，同樣第二大類中黃麻和綠麻先聚在一起，再與其它產(chǎn)地的綠麻聚為一大類，這一方面

15、說明野生天麻種間變異度比擬小，紅麻和烏麻遺傳相似度比擬大，黃麻和綠麻遺傳相似度比擬大。另一方面也反映了不同產(chǎn)地的同一品種間變異度比擬大，說明不同的環(huán)境因素可能是造成天麻遺傳變異的主要因素。此與鄒佳寧等對(duì)野生和栽培天麻親緣關(guān)系的RAPD分析結(jié)果有相似之處，鄒佳寧等認(rèn)為，地理分布和生長環(huán)境的差異是導(dǎo)致天麻形成豐富的遺傳多態(tài)性的一個(gè)重要的原因。野生天麻種質(zhì)在長期的自然選擇下積累了豐富的遺傳變異，遺傳組成異常復(fù)雜，有必要結(jié)合形態(tài)與分子分類對(duì)野生天麻種質(zhì)資源進(jìn)展更深化的研究，以便為野生天麻種質(zhì)資源利用提供科學(xué)根據(jù)。此外，不同生態(tài)區(qū)野生天麻品種間遺傳差異相對(duì)較大。在進(jìn)展天麻雜交育種時(shí)，應(yīng)盡可能選擇生態(tài)類型

16、差異較大的育種材料，以使雜交后代有更多時(shí)機(jī)出現(xiàn)理想的性狀組合，培育出更多更好的天麻新品種?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1鄒佳寧,宋聚先,常楚瑞，等.貴州天麻種質(zhì)資源的RAPD分析J.中藥材，2022,299：881.2趙永亮，傅體華，范巧佳，等.野生天麻栽培天麻的RAPD和AFLP標(biāo)記遺傳多態(tài)性分析J.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2022，36(17):7119.3關(guān)萍，馬丹煒，王貴俠，等.利用ISSR標(biāo)記對(duì)天麻的貴州種群遺傳多樣性分析J.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，296：35.4常楚瑞,王曉麗.一種適于AFLP分析的天麻花葶DNA提取方法J.貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2022，306：502.5李相陵，王曉玲，劉安發(fā).天麻總DNA提取的研究J.貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2022，305：399.6顏?zhàn)臃f，王海林譯.精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南.北京：科學(xué)出版社，1998，6:37.7郭寶林,李家實(shí),閻玉凝.中藥材DNA分子標(biāo)記研究的技術(shù)問題(1)植物藥基因組DNA的提取J.中草藥,2000,31(12):951.8Z