牛5種病毒性腹瀉病診斷和防治技術(shù)規(guī)程

1、Q/LB.XXXXX-XXXX目次 TOC o 1-1 h t 標(biāo)準(zhǔn)文件_一級條標(biāo)題,2,標(biāo)準(zhǔn)文件_附錄一級條標(biāo)題,2, HYPERLINK l _Toc84601730 前言 PAGEREF _Toc84601730 h II HYPERLINK l _Toc84601731 1 范圍 PAGEREF _Toc84601731 h 1 HYPERLINK l _Toc84601732 2 規(guī)范性引用文件 PAGEREF _Toc84601732 h 1 HYPERLINK l _Toc84601733 3 術(shù)語和定義 PAGEREF _Toc84601733 h 1 HYPERLINK l

2、_Toc84601734 4 診斷 PAGEREF _Toc84601734 h 2 HYPERLINK l _Toc84601735 4.1 臨床疑似病例判斷依據(jù) PAGEREF _Toc84601735 h 2 HYPERLINK l _Toc84601736 4.2 熒光定量RT-PCR鑒定腹瀉相關(guān)病毒 PAGEREF _Toc84601736 h 2 HYPERLINK l _Toc84601737 5 防治措施 PAGEREF _Toc84601737 h 2 HYPERLINK l _Toc84601738 5.1 隔離 PAGEREF _Toc84601738 h 2 HYPER

3、LINK l _Toc84601739 5.2 消毒 PAGEREF _Toc84601739 h 2 HYPERLINK l _Toc84601740 5.3 對癥治療 PAGEREF _Toc84601740 h 2 HYPERLINK l _Toc84601741 5.4 特異性抗體治療 PAGEREF _Toc84601741 h 2 HYPERLINK l _Toc84601742 5.5 疫苗緊急免疫 PAGEREF _Toc84601742 h 2 HYPERLINK l _Toc84601743 6 無害化處理 PAGEREF _Toc84601743 h 2 HYPERLIN

4、K l _Toc84601744 附錄A（規(guī)范性） 牛5種腹瀉病毒熒光PCR檢測方法及結(jié)果判定 PAGEREF _Toc84601744 h 3 HYPERLINK l _Toc84601745 A.1 引物及探針 PAGEREF _Toc84601745 h 3 HYPERLINK l _Toc84601746 A.2 牛5種腹瀉病毒熒光PCR檢測方法及結(jié)果判定 PAGEREF _Toc84601746 h 3前言本文件按照GB/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。本文件由四川省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件由四川省市場監(jiān)督管理局批準(zhǔn)發(fā)布。本文件起

5、草單位：西南民族大學(xué)本文件主要起草人：湯承 張煥容 任玉鵬 向華 岳華 王遠(yuǎn)微 牛5種病毒性腹瀉病診斷和防治技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了牛病毒性腹瀉黏膜病病毒、牛冠狀病毒、牛輪狀病毒、牛紐布病毒和牛諾如病毒共5種病毒引起的牛病毒性腹瀉病臨床診斷和防治技術(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于上述5種腹瀉相關(guān)病毒的檢測,病毒性腹瀉病診斷、疫情處理、預(yù)防與控制。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/ T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法GB/ T 1863

6、7-2018 牛病毒性腹瀉粘膜病診斷技術(shù)規(guī)范GB/ T 19489 實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/ T 541-2016獸醫(yī)診斷樣本采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1 牛病毒性腹瀉黏膜病 Bovine viral diarrhea-mucosal disease牛病毒性腹瀉黏膜?。˙ovine viral diarrhea-mucosal disease, BVD/MD）是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus, BVDV）感染引起的一種病毒性傳染病。BVDV可引起牛呼吸道綜合征、繁殖障礙性疾病、腹瀉/黏膜病、免疫抑制和持續(xù)性

7、感染等。該病呈全球性流行，在養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達(dá)國家危害尤為嚴(yán)重，造成全球乳/肉牛業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在我國，BVD是進(jìn)口動物檢疫的二類傳染病和跨省交易運(yùn)輸必檢的疫病。BVDV是單股正鏈RNA病毒，基因組約為12kb13kb。整個基因組由三個部分組成，可分為5端非編碼區(qū)（5untranslated region, 5UTR）、開放閱讀框架區(qū)（open reading frame, ORF）和3端非編碼區(qū)（3untranslated region, 3UTR）。3.2 牛輪狀病毒病 Bovine Rotavirus disease牛輪狀病毒病是由牛輪狀病毒（Bovine Rotavirus，BRV）引起的以

8、嘔吐、腹瀉、脫水等為主要特征的人畜共患急性胃腸道傳染病，尤其在幼齡動物中高發(fā)。該病已在全世界主要養(yǎng)牛國家和地區(qū)普遍發(fā)生和流行，給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。BRV為呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，無囊膜雙鏈RNA病毒，分11個基因節(jié)段，分別編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白（VPlVP4、VP6、VP7）和6種非結(jié)構(gòu)蛋白（NSPlNSP6）。3.3 牛冠狀病毒病 Bovine Coronavirus disease牛冠狀病毒病是由牛冠狀病毒（Bovine Coronavirus, BCoV）引起的新生犢牛腹瀉、成年牛冬季腹瀉和各年齡段牛呼吸道疾病。BCoV為不分段的單股正鏈RNA病毒，有囊膜?；蚪M全長大小介于3084

9、7 bp31100 bp，具有2個開放閱讀框ORF1a和ORF1b，五種主要的結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白（S）、血凝素/酯酶蛋白（HE）、核衣殼蛋白（N）、跨膜蛋白（M）和小膜蛋白（E）。3.4 牛紐布病毒病 Nebovirus disease牛紐布病毒病是由紐布病毒（Nebovirus, NeV）引起犢牛腹瀉的疾病。NeV為單股正鏈RNA病毒，根據(jù)其重組酶聚合酶（RdRp）基因序列，NeV 可以分為 NB-like、NA1-like 和 DijonA216-like 3 種基因型；根據(jù)其完整VP1基因序列，NeV可以分為2個基因型（基因1型和基因2型），其中基因1型又細(xì)分為4個譜系（譜系14）。3.

10、5 牛諾如病毒病 Bovine norovirus disease牛諾如病毒病是由牛諾如病毒（Bovine norovirus, BNoV）引起的一種犢牛腹瀉的疾病。NoV屬于杯狀病毒科，諾如病毒屬，是單鏈的 RNA 病毒，基因組全長7.37.5kb。根據(jù)其基因特征，可將NoV分為6個基因型。診斷臨床癥狀感染牛主要表現(xiàn)為體溫升高，精神沉郁，食欲減退或廢絕；多數(shù)病牛出現(xiàn)不同程度的腹瀉，排出水樣稀糞，內(nèi)有氣泡、粘液或血，氣味惡臭；病牛甚至迅速脫水，死亡。熒光定量RT-PCR鑒定腹瀉相關(guān)病毒4.2.1 樣本采集與處理 采集肛門棉拭子 510 g，置RNA保存液，-20及以下保存運(yùn)輸不超過48 h,提

11、取并反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。4.2.2 樣本檢測 依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)附錄A中提供的牛病毒性腹瀉粘膜病病毒、牛冠狀病毒、牛輪狀病毒、牛紐布病毒和牛諾如病毒熒光定量RT-PCR或iiPCR方法鑒定5種主要的牛腹瀉相關(guān)病毒。防治措施隔離：發(fā)現(xiàn)疑似疫情，立即隔離患病動物。消毒：對病牛污染的場所、用具、物品徹底消毒。對癥治療：采取補(bǔ)液、強(qiáng)心、止瀉和防止細(xì)菌繼發(fā)感染等措施治療患病動物。補(bǔ)液：復(fù)方氯化鈉或生理鹽水，重癥者輸注5%葡萄糖生理鹽水或一定量的10%低分子右旋糖酐補(bǔ)液。強(qiáng)心：在補(bǔ)液同時選用毛花苷C、洋地黃毒苷、毒毛旋花苷K等強(qiáng)心劑強(qiáng)心。止瀉：每頭?？诜A式硝酸鉍1530 g形成一層薄膜保護(hù)腸壁止瀉。防止細(xì)菌繼

12、發(fā)感染：單一或聯(lián)合使用喹諾酮類、氨基糖苷類、頭孢類、磺胺類或酰胺醇類抗菌藥物等12種防止細(xì)菌繼發(fā)感染，采用肌肉注射或靜脈注射。特異性抗體治療：高免血清或卵黃抗體對發(fā)病牛緊急治療，對受威脅牛緊急預(yù)防。疫苗緊急免疫：牛病毒性腹瀉相關(guān)病毒疫苗緊急免疫預(yù)防。無害化處理患病牛及其產(chǎn)品按照“農(nóng)業(yè)部關(guān)于印發(fā)病死及病害動物無害化處理技術(shù)規(guī)范”進(jìn)行無害化處理。（規(guī)范性）牛5種腹瀉病毒熒光PCR檢測方法及結(jié)果判定引物及探針（10mol/L）NeV-F：5-CAGCCCGTCTGGGTGAAT-3；NeV-R：5-CTGGATRGTTCTGACTTCGG-3；BNoV-F：5-CCTYCACGGCGAGAAGTT-

13、3BNoV-R：5- CGGWGCGATGGTACAAARAT -3BCoV-F：5-AGTAGTGTCAGTGCTAAC-3BCoV-R：5-CAAGTGCCTGTAGGTATA-3BCoV-Probe：5-FAM-ACAACTTCCATCCCGCCAAA-TAMRA-3BVDV1-F：5-AAGCCTCGAGATGCCACG-3；BVDV1-R：5-GCAGCACCCTATCAGGCTGT-3；BVDV1-Probe：5-FAM-CCCACAGCACATCTTAA-MGB3BRV-F：GCTAACCACTTGGTATCCGBRV-R：GCCATCTGAGTGATTACTCTGBRV-Pro

14、be：FAM-TACGTATTCGCTACACAGAGTAATCA-BHQ1牛5種腹瀉病毒熒光PCR檢測方法及結(jié)果判定NeV 染料法 real-time PCR 檢測反應(yīng)體系及條件反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex Taq II 10 L，上、下游引物各 1.0 L，cDNA模板1.5 L，用DEPC H2O補(bǔ)齊到 20L。反應(yīng)條件為：95 1 min；95 15 s、51 30 s，共40 個循環(huán)；熔解段 95 15s、60 1 min、95 ，15s，1個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束。結(jié)果判定閾值設(shè)定檢測結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值直接讀取檢測結(jié)果，Ct值為每個反應(yīng)管的熒光信號達(dá)到設(shè)定

15、的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陰性對照無Ct值，且無典型擴(kuò)增曲線；或陰性對照Ct值35.0，出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，但熔解曲線于88左右未出現(xiàn)明顯的峰值，熔解曲線于84左右未出現(xiàn)明顯的峰值。陽性對照Ct值35.0，出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，但熔解曲線于88左右未出現(xiàn)明顯的峰值，表示樣品中無病毒核酸，判定為陰性。Ct值35.0，出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，熔解曲線于88左右出現(xiàn)明顯的峰值，表示樣品中存在病毒核酸，判定為陽性。30.0Ct值35.0，出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，但熔解曲線于88左右未出現(xiàn)明顯的峰值，熔解曲線于84左右未出現(xiàn)明顯的峰值。陽

16、性對照Ct值35.0，出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，但熔解曲線于88左右未出現(xiàn)明顯的峰值，表示樣品中無病毒核酸，判定為陰性。Ct值35.0，出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，熔解曲線于88左右出現(xiàn)明顯的峰值，表示樣品中存在病毒核酸，判定為陽性。 30.0Ct值35.0，且出現(xiàn)擴(kuò)增曲線的樣本判定為可疑。可疑樣本進(jìn)行雙孔重復(fù)試驗(yàn)，若任一孔或兩孔重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果為陽性者判為陽性，否則判為陰性。BCoV 探針法 real-time PCR 檢測反應(yīng)體系及條件PCR反應(yīng)體系：Probe qPCR Premix Ex Taq 10 L，探針0.4 L（10 mol/L），上下游引物各0.8 L（10 mol/L），cDNA模板2 L，DE

17、PC H2O補(bǔ)足到20 L。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 2 min；95 15 s，54 20 s（采集熒光），40個循環(huán)。結(jié)果判定閾值設(shè)定閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴(kuò)增的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。質(zhì)量控制陰性對照：FAM通道無報(bào)告Ct值或無典型的S型擴(kuò)增曲線，TAMRA通道無報(bào)告Ct值或無典型的S型擴(kuò)增曲線。陽性對照：FAM通道CT值35，TAMRA35，且2個通道擴(kuò)增曲線均為典型的S型。上述陰性對照和陽性對照結(jié)果要求在同一次實(shí)驗(yàn)中同時滿足，否則，本次試驗(yàn)無效，需重新進(jìn)行。結(jié)果描述及判定被檢樣本檢測結(jié)果中 FAM 通道Ct值36，TAMRA 通道36，且擴(kuò)增曲線均為典型的S曲

18、線，報(bào)告為BCoV核酸陽性；36Ct值40，判定為可疑，可疑樣品應(yīng)重新檢測，如重復(fù)后仍為36Ct值40，且擴(kuò)增曲線均為典型的S曲線，報(bào)告為BCoV核酸陽性。被檢樣本檢測結(jié)果中 FAM 和 TAMRA 通道均無CT值或無典型的S型擴(kuò)增曲線，報(bào)告為 BCoV 核酸陰性。BVDV 1型 iiPCR 檢測反應(yīng)體系及條件反應(yīng)體系：Taq酶 1L，預(yù)混Buffer 25L，引物上下游各 3.5L（10molL-1），探針 0.3L（10molL-1），反轉(zhuǎn)錄酶1.5L（20UL-1），cDNA模板2L，DEPC H2O 13.2L，共 50L。反應(yīng)條件：42，30 min，93，15 sec，60,1 m

19、in，40個循環(huán)。反應(yīng)信號由iiPCR儀光學(xué)探測模塊自動識別，其反應(yīng)結(jié)果通過系統(tǒng)默認(rèn)的S/N值進(jìn)行計(jì)算并被轉(zhuǎn)化為 “+” (positive)，“” (negative) 和 “？” (inconclusive) 顯示在屏幕上。結(jié)果判定質(zhì)量控制陰性對照：經(jīng) iiPCR 反應(yīng)，結(jié)果顯示為“-”。陽性對照：經(jīng) iiPCR 反應(yīng)，結(jié)果顯示為“+”。上述陰性對照和陽性對照結(jié)果要求在同一次實(shí)驗(yàn)中同時滿足，否則，本次試驗(yàn)無效，需重新進(jìn)行。結(jié)果判定被檢樣本檢測結(jié)果中，iiPCR儀顯示為“+”者判定為陽性；iiPCR儀顯示為“-”判定為陰性。BRV iiPCR 檢測反應(yīng)體系及條件反應(yīng)體系：Taq酶 1L，預(yù)混

20、Buffer 25L，引物上下游各 3.5L (10molL-1)、探針0.25 L (10molL-1)、反轉(zhuǎn)錄酶 1.25L (20UL-1)、cDNA模板 2L、DEPC H2O 13.5L，共 50L。反應(yīng)條件：42，30 min，93，15 sec，60,1 min，40個循環(huán)。結(jié)果判定質(zhì)量控制陰性對照：經(jīng) iiPCR 反應(yīng)，結(jié)果顯示為“-”。陽性對照：經(jīng) iiPCR 反應(yīng)，結(jié)果顯示為“+”。上述陰性對照和陽性對照結(jié)果要求在同一次實(shí)驗(yàn)中同時滿足，否則，本次試驗(yàn)無效，需重新進(jìn)行。結(jié)果判定被檢樣本檢測結(jié)果中，iiPCR儀顯示為“+”者判定為陽性；iiPCR儀顯示為“-”判定為陰性。參考文

21、獻(xiàn)農(nóng)業(yè)部關(guān)于印發(fā)病死及病害動物無害化處理技術(shù)規(guī)范。牛5種病毒性腹瀉病診斷和防治技術(shù)規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)編制說明一、編制目的及任務(wù)來源牛病毒性腹瀉是養(yǎng)牛業(yè)中最常見的疾病，一年四季皆可發(fā)病，各養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達(dá)國家均有流行，給我國的養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。牛病毒性腹瀉由多種病毒引起，主要有牛病毒性腹瀉黏膜病病毒、牛冠狀病毒、牛輪狀病毒、牛紐布病毒和牛諾如病毒5種病毒。這5種病毒感染過程中具有發(fā)熱、腹瀉及脫水等相似的癥狀，治療不及時易導(dǎo)致犢牛死亡，也會嚴(yán)重影響牛犢的正常生長發(fā)育。精準(zhǔn)診斷、疫苗免疫、抗菌和補(bǔ)液是防治牛病毒性腹瀉的主要手段。幾種牛病引起的腹瀉病的診斷和防治技術(shù)具有相似之處，如臨床癥狀、疫苗免疫、特異性

22、抗體治療、抗菌和補(bǔ)液治療。目前，國內(nèi)外已有針對牛病毒性腹瀉的臨床診斷、實(shí)驗(yàn)室診斷、預(yù)防和治療等技術(shù)。但需要標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化，以指導(dǎo)該技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用。因此，在參考國內(nèi)外最新研究進(jìn)展的基礎(chǔ)上，結(jié)合本標(biāo)準(zhǔn)起草單位的研究成果，申報(bào)起草牛5種病毒性腹瀉病診斷和防治技術(shù)規(guī)程。該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了牛5種腹瀉相關(guān)病毒感染引起的腹瀉病的臨床疑似病例的判斷，樣本采集與處理，熒光RT-PCR檢測，疫苗預(yù)防，抗菌和特異性抗體治療和補(bǔ)液對癥治療等規(guī)范。填補(bǔ)國內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的空白。為了促進(jìn)我國養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展，結(jié)合“十三五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技支撐計(jì)劃課題牛羊主要疫病綜合防控技術(shù)集成、創(chuàng)新與應(yīng)用 (2016YFD0500907)，標(biāo)準(zhǔn)

23、起草單位提出制訂牛5種病毒性腹瀉病診斷和防治技術(shù)規(guī)程。二、編制過程本標(biāo)準(zhǔn)下達(dá)后，西南民族大學(xué)成立了牛5種病毒性腹瀉病診斷和防治技術(shù)規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)編制小組。結(jié)合“十三五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技支撐計(jì)劃課題牛羊主要疫病綜合防控技術(shù)集成、創(chuàng)新與應(yīng)用 (2016YFD0500907)的實(shí)施，組織專家多次深入四川、青海和西藏等青藏高原牧區(qū)開展關(guān)于牛病毒性腹瀉黏膜病、牛冠狀病毒病、牛輪狀病毒病、牛紐布病毒病和牛諾如病毒病等5種牛病毒引起的腹瀉病的診斷和防治工作。同時，在實(shí)驗(yàn)室對5種牛病毒性腹瀉病毒的病原學(xué)特性及分子生物學(xué)特性等展開研究，對5種牛病毒性腹瀉病診斷和防治技術(shù)規(guī)范所涉及的臨床癥狀判斷標(biāo)準(zhǔn)，樣本的采集與處理規(guī)范，熒光RT-PCR檢測，疫苗預(yù)防，抗菌和特異性抗體治療和補(bǔ)液對癥治療等進(jìn)行驗(yàn)證和優(yōu)化。最終根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究成果，并廣泛征求省內(nèi)外相關(guān)專家的意見，形成了本標(biāo)準(zhǔn)（征求意見稿），并廣泛征求專家意見后，根據(jù)專家意見，在征求意見稿的基