免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測培訓(xùn)課件

1、免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測Part I 補(bǔ)體參與的反應(yīng) 補(bǔ)體的溶血反應(yīng) Part II T細(xì)胞數(shù)量及其功能檢測 E花環(huán)形成試驗數(shù)量測定 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗： 形態(tài)學(xué)方法 3HTDR摻入法 MTT比色法 功能2免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測Part I 補(bǔ)體參與的反應(yīng)功能2免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng) 補(bǔ)體激活的三條途徑經(jīng)典途徑MBL途徑旁路途徑IC+C1qMBL+病原體配基細(xì)菌+C3膜攻擊復(fù)合物細(xì)胞溶解Part I 補(bǔ)體參與的反應(yīng)復(fù)習(xí)3免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測 補(bǔ)體激活的三條途徑經(jīng)典途徑MBL途徑旁路途徑IC+1.補(bǔ)體的溶血反

2、應(yīng) 原理 綿羊紅細(xì)胞（SRBC ）作為抗原與其相應(yīng)抗體（溶血素）結(jié)合后，通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體，產(chǎn)生膜攻擊作用，最后導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解，發(fā)生溶血反應(yīng)。 材料 1抗原：2%綿羊紅細(xì)胞； 2抗體(溶血素)； 3補(bǔ)體：健康豚鼠新鮮血清 4生理鹽水、24孔板等。 4免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測1.補(bǔ)體的溶血反應(yīng) 原理4免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其孔號 SRBC溶血素補(bǔ)體NS13滴3滴3滴3滴23滴3滴6滴33滴3滴6滴43滴9滴 步驟1、取24孔板，按下表加入各成分； 2、將24孔板放在37溫箱內(nèi)15-30min，觀察并記錄結(jié)果。結(jié)果:5免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測孔號 SRBC

3、溶血素補(bǔ)體NS13滴3滴3滴3滴23滴3滴6Part II T細(xì)胞數(shù)量及其功能檢測6免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測Part II T細(xì)胞數(shù)量及其功能檢測6免疫學(xué)補(bǔ)體參和2.E花環(huán)形成試驗 原理人外周血T細(xì)胞表面具有天然的能與綿羊紅細(xì)胞(SRBC)表面糖肽相結(jié)合的受體E受體（CD2分子），可結(jié)合SRBC形成花環(huán)樣細(xì)胞團(tuán)，是T細(xì)胞特有的表面標(biāo)志。 檢測T細(xì)胞數(shù)量，間接判斷機(jī)體的細(xì)胞免疫狀況 。7免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測2.E花環(huán)形成試驗 原理 檢測T細(xì)胞數(shù)量，間接判斷機(jī)體的免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測培訓(xùn)課件 步驟： （動作輕柔；分清滴管及槍頭?。┤「嗡乜鼓?/p>

4、與等量Hanks液稀釋混勻血3ml，用滴管貼管壁（傾斜30）輕輕疊加于3ml分離液上（界面要清晰） 配平后1800rpm離心13mins。 1.淋巴細(xì)胞懸液的制備：人淋巴細(xì)胞比重：1.070淋巴細(xì)胞分層液：1.077人紅細(xì)胞比重：1.0929免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測 步驟： （動作輕柔；分清滴管及槍頭！稀釋的血液 分層液離心前稀釋的血漿 單個核細(xì)胞分層液粒細(xì)胞紅細(xì)胞離心后10免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測稀釋的血液 離心前稀釋的血漿 離心后10免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T11免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測11免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測 另取一支滴管，仔

5、細(xì)吸出位于血漿和分離液之間的乳白色的單個核細(xì)胞，放入盛有5mlHanks液的試管2000rpm離心5mins。(3)棄上清（傾倒時液體不要回流），將沉淀的淋巴細(xì)胞輕彈混勻后加入Hanks液5ml，重復(fù)離心兩次。2.棄去上清，留經(jīng)過洗滌的淋巴細(xì)胞懸液（約0.1ml）與綿羊紅細(xì)胞0.1ml 、1640營養(yǎng)液0.1ml混合（分清槍頭）輕彈混勻后放于37溫箱15mins。離心時要配平12免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測 另取一支滴管，仔細(xì)吸出位于血漿和分離液之間的乳白色的3. 取出試管，500rpm離心5mins。（注意此步非常關(guān)鍵，轉(zhuǎn)速一定要慢，一啟動即關(guān)，來回數(shù)次即可）,室溫靜置2-3mi

6、ns4. 吸去100-150ul上清液，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，沿管壁滴加1滴(50ul)戊二醛，輕輕混勻靜置5mins。5. 取一滴（25ul）液體滴片，加一滴燦爛甲酚蘭染液，加蓋玻片。13免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測3. 取出試管，500rpm離心5mins。（注意此步非常關(guān)6.高倍鏡下觀察，計數(shù)100個淋巴細(xì)胞，計算花環(huán)形成率。淋巴細(xì)胞上結(jié)合3個SRBC者為E花環(huán)陽性。正常參考值：EtRFC：64.46.7； EaRFC：23.63.5； EsRFC：3.32.614免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測6.高倍鏡下觀察，計數(shù)100個淋巴細(xì)胞，計算花環(huán)形成率。淋巴 結(jié)果T 淋巴細(xì)胞S

7、RBC15免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測 結(jié)果T 淋巴細(xì)胞SRBC15免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量16免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測16免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗 原理 T細(xì)胞在體外培養(yǎng)時，受到非特異性有絲分裂原(如PHA、ConA)或特異性抗原刺激后，可出現(xiàn)代謝旺盛、蛋白質(zhì)和核酸合成增加、細(xì)胞體積增大并能進(jìn)行分裂的淋巴母細(xì)胞，稱淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的高低，可反映機(jī)體的細(xì)胞免疫水平，故可作為測定機(jī)體免疫功能的指標(biāo)。三種方法形態(tài)學(xué)方法、 3H-TdR摻入法、 MTT比色法17免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗 原

8、理17免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù) 根據(jù)胞核的大小、核與胞漿的比例、胞漿染色性、核的構(gòu)造與核仁的有無。成熟小淋巴細(xì)胞：核染色深、沒有核仁，胞漿少、染色為輕度嗜堿性；過渡型淋巴細(xì)胞：大于小淋巴細(xì)胞、核染色比較疏松，胞漿比較多，但是出現(xiàn)核仁；淋巴母細(xì)胞：體積增大，形態(tài)不規(guī)則，核變大、核質(zhì)染色疏松，有核仁12個，胞漿豐富，常出現(xiàn)胞漿空泡；其他細(xì)胞：中性粒細(xì)胞在培養(yǎng)72消失后，絕大部分衰變或死亡呈碎片。形態(tài)學(xué)方法：鏡下觀察 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗18免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測 根據(jù)胞核的大小、核與胞漿的比例、胞漿染色性、核的構(gòu)造淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞100正

9、常參考值：80紅細(xì)胞未轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗 瑞氏染色 1040 19免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)20免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測20免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測3HTDR摻入法 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗 T細(xì)胞受到PHA或特異性抗原刺激后，發(fā)生有絲分裂，細(xì)胞進(jìn)入S期，此時在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入氚標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TDR)，可以被細(xì)胞攝入而摻入DNA中，通過-液體閃爍計數(shù)器測定3H-TDR的摻入量，判斷細(xì)胞的增殖程度。 21免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測3HTDR摻入法

10、MTT比色法 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗 MTT為一種黃色可溶性物質(zhì)，細(xì)胞活化增殖時通過線粒體能量代謝，將MTT代謝成藍(lán)紫色的甲臢，沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍，形成甲臢的量與細(xì)胞活化增殖的程度呈正比。甲臢經(jīng)鹽酸異丙醇溶解后呈紫藍(lán)色，置于酶標(biāo)儀下根據(jù)顯色程度即可知道甲臢量并反映細(xì)胞活化程度。 22免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測MTT比色法 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗 MTT Formazan Insoluble23免疫學(xué)補(bǔ)體參和反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量和其功能檢測 MTT Formazan Insoluble23免疫學(xué)1. 補(bǔ)體溶血反應(yīng)的原理、步驟、結(jié)果及分析。2. E花環(huán)形成試驗的原理、步驟、繪制鏡下觀察結(jié)果。3. 繪制淋巴