免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測培訓課件

1、免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測Part I 補體參與的反應 補體的溶血反應 Part II T細胞數(shù)量及其功能檢測 E花環(huán)形成試驗數(shù)量測定 淋巴細胞轉化試驗： 形態(tài)學方法 3HTDR摻入法 MTT比色法 功能2免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測Part I 補體參與的反應功能2免疫學補體參和反應 補體激活的三條途徑經典途徑MBL途徑旁路途徑IC+C1qMBL+病原體配基細菌+C3膜攻擊復合物細胞溶解Part I 補體參與的反應復習3免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測 補體激活的三條途徑經典途徑MBL途徑旁路途徑IC+1.補體的溶血反

2、應 原理 綿羊紅細胞（SRBC ）作為抗原與其相應抗體（溶血素）結合后，通過經典途徑激活補體，產生膜攻擊作用，最后導致紅細胞溶解，發(fā)生溶血反應。 材料 1抗原：2%綿羊紅細胞； 2抗體(溶血素)； 3補體：健康豚鼠新鮮血清 4生理鹽水、24孔板等。 4免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測1.補體的溶血反應 原理4免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其孔號 SRBC溶血素補體NS13滴3滴3滴3滴23滴3滴6滴33滴3滴6滴43滴9滴 步驟1、取24孔板，按下表加入各成分； 2、將24孔板放在37溫箱內15-30min，觀察并記錄結果。結果:5免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測孔號 SRBC

3、溶血素補體NS13滴3滴3滴3滴23滴3滴6Part II T細胞數(shù)量及其功能檢測6免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測Part II T細胞數(shù)量及其功能檢測6免疫學補體參和2.E花環(huán)形成試驗 原理人外周血T細胞表面具有天然的能與綿羊紅細胞(SRBC)表面糖肽相結合的受體E受體（CD2分子），可結合SRBC形成花環(huán)樣細胞團，是T細胞特有的表面標志。 檢測T細胞數(shù)量，間接判斷機體的細胞免疫狀況 。7免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測2.E花環(huán)形成試驗 原理 檢測T細胞數(shù)量，間接判斷機體的免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測培訓課件 步驟： （動作輕柔；分清滴管及槍頭！）取肝素抗凝血

4、與等量Hanks液稀釋混勻血3ml，用滴管貼管壁（傾斜30）輕輕疊加于3ml分離液上（界面要清晰） 配平后1800rpm離心13mins。 1.淋巴細胞懸液的制備：人淋巴細胞比重：1.070淋巴細胞分層液：1.077人紅細胞比重：1.0929免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測 步驟： （動作輕柔；分清滴管及槍頭！稀釋的血液 分層液離心前稀釋的血漿 單個核細胞分層液粒細胞紅細胞離心后10免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測稀釋的血液 離心前稀釋的血漿 離心后10免疫學補體參和反應T11免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測11免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測 另取一支滴管，仔

5、細吸出位于血漿和分離液之間的乳白色的單個核細胞，放入盛有5mlHanks液的試管2000rpm離心5mins。(3)棄上清（傾倒時液體不要回流），將沉淀的淋巴細胞輕彈混勻后加入Hanks液5ml，重復離心兩次。2.棄去上清，留經過洗滌的淋巴細胞懸液（約0.1ml）與綿羊紅細胞0.1ml 、1640營養(yǎng)液0.1ml混合（分清槍頭）輕彈混勻后放于37溫箱15mins。離心時要配平12免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測 另取一支滴管，仔細吸出位于血漿和分離液之間的乳白色的3. 取出試管，500rpm離心5mins。（注意此步非常關鍵，轉速一定要慢，一啟動即關，來回數(shù)次即可）,室溫靜置2-3mi

6、ns4. 吸去100-150ul上清液，輕輕旋轉混勻，沿管壁滴加1滴(50ul)戊二醛，輕輕混勻靜置5mins。5. 取一滴（25ul）液體滴片，加一滴燦爛甲酚蘭染液，加蓋玻片。13免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測3. 取出試管，500rpm離心5mins。（注意此步非常關6.高倍鏡下觀察，計數(shù)100個淋巴細胞，計算花環(huán)形成率。淋巴細胞上結合3個SRBC者為E花環(huán)陽性。正常參考值：EtRFC：64.46.7； EaRFC：23.63.5； EsRFC：3.32.614免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測6.高倍鏡下觀察，計數(shù)100個淋巴細胞，計算花環(huán)形成率。淋巴 結果T 淋巴細胞S

7、RBC15免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測 結果T 淋巴細胞SRBC15免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量16免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測16免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測淋巴細胞轉化試驗 原理 T細胞在體外培養(yǎng)時，受到非特異性有絲分裂原(如PHA、ConA)或特異性抗原刺激后，可出現(xiàn)代謝旺盛、蛋白質和核酸合成增加、細胞體積增大并能進行分裂的淋巴母細胞，稱淋巴細胞轉化現(xiàn)象。淋巴細胞轉化率的高低，可反映機體的細胞免疫水平，故可作為測定機體免疫功能的指標。三種方法形態(tài)學方法、 3H-TdR摻入法、 MTT比色法17免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測淋巴細胞轉化試驗 原

8、理17免疫學補體參和反應T細胞數(shù) 根據(jù)胞核的大小、核與胞漿的比例、胞漿染色性、核的構造與核仁的有無。成熟小淋巴細胞：核染色深、沒有核仁，胞漿少、染色為輕度嗜堿性；過渡型淋巴細胞：大于小淋巴細胞、核染色比較疏松，胞漿比較多，但是出現(xiàn)核仁；淋巴母細胞：體積增大，形態(tài)不規(guī)則，核變大、核質染色疏松，有核仁12個，胞漿豐富，常出現(xiàn)胞漿空泡；其他細胞：中性粒細胞在培養(yǎng)72消失后，絕大部分衰變或死亡呈碎片。形態(tài)學方法：鏡下觀察 淋巴細胞轉化試驗18免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測 根據(jù)胞核的大小、核與胞漿的比例、胞漿染色性、核的構造淋巴細胞轉化率：轉化的淋巴細胞轉化的淋巴細胞未轉化的淋巴細胞100正

9、常參考值：80紅細胞未轉化淋巴細胞轉化的淋巴細胞淋巴細胞轉化實驗 瑞氏染色 1040 19免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測淋巴細胞轉化率：轉化的淋巴細胞轉化的淋巴細胞未轉化的淋巴細20免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測20免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測3HTDR摻入法 淋巴細胞轉化試驗 T細胞受到PHA或特異性抗原刺激后，發(fā)生有絲分裂，細胞進入S期，此時在細胞培養(yǎng)液中加入氚標記的胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TDR)，可以被細胞攝入而摻入DNA中，通過-液體閃爍計數(shù)器測定3H-TDR的摻入量，判斷細胞的增殖程度。 21免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測3HTDR摻入法

10、MTT比色法 淋巴細胞轉化試驗 MTT為一種黃色可溶性物質，細胞活化增殖時通過線粒體能量代謝，將MTT代謝成藍紫色的甲臢，沉積于細胞內或細胞周圍，形成甲臢的量與細胞活化增殖的程度呈正比。甲臢經鹽酸異丙醇溶解后呈紫藍色，置于酶標儀下根據(jù)顯色程度即可知道甲臢量并反映細胞活化程度。 22免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測MTT比色法 淋巴細胞轉化試驗 MTT Formazan Insoluble23免疫學補體參和反應T細胞數(shù)量和其功能檢測 MTT Formazan Insoluble23免疫學1. 補體溶血反應的原理、步驟、結果及分析。2. E花環(huán)形成試驗的原理、步驟、繪制鏡下觀察結果。3. 繪制淋巴