免疫組織化學(xué)技術(shù)培訓(xùn)課件

1、免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry）又稱免疫細(xì)胞化學(xué)。它是組織化學(xué)的分支，它是用標(biāo)記的特異性抗體（或抗原）對組織內(nèi)抗原（或抗體）的分布進(jìn)行組織和細(xì)胞原位檢測的技術(shù)。免疫組織化學(xué)技術(shù)2免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry）又稱 基本原理 抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。免疫組織化學(xué)技術(shù)3 基本原理免疫組織化學(xué)技術(shù)3免疫組化的特點(diǎn) 特異性強(qiáng) 敏感性高 定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功能相結(jié)合

2、免疫組織化學(xué)技術(shù)4免疫組化的特點(diǎn)免疫組織化學(xué)技術(shù)4 免疫組化的作用凡是組織細(xì)胞內(nèi)具有抗原性的物質(zhì)，如肽類、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、受體、表面抗原等等均可用免疫組織化學(xué)方法顯示 。免疫組織化學(xué)技術(shù)5 免疫組化的作用凡是組織細(xì)胞內(nèi)具有抗原性的物質(zhì)，如 實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)本石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究 。細(xì)胞標(biāo)本組織印片細(xì)胞爬片細(xì)胞涂片組織標(biāo)本石蠟切片冰凍切片病理切片組織芯片免疫組織化學(xué)技術(shù)6 實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)本石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 恒溫冰凍切片機(jī)、脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)、攤片機(jī)、烤片

3、機(jī)、冰箱、電磁爐、高壓鍋、染色架以及離心機(jī)和免疫組化試劑等免疫組織化學(xué)技術(shù)7 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 恒溫冰凍切片機(jī)、脫免疫組織化學(xué)技術(shù)8免疫組織化學(xué)技術(shù)8免疫組織化學(xué)技術(shù)9免疫組織化學(xué)技術(shù)9 脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)免疫組織化學(xué)技術(shù)10 免疫組化技術(shù)分類 1、免疫熒光方法 2、免疫酶標(biāo)方法 3、免疫膠體金技術(shù) 4、免疫鐵蛋白法 5、放射免疫自顯影法免疫組織化學(xué)技術(shù)11 免疫組化技術(shù)分類 1、免疫熒光方法免疫組酶聯(lián)免疫組織化學(xué) ABC法 S - P法免疫組織化學(xué)技術(shù)12酶聯(lián)免疫組織化學(xué) ABC法免疫組織化學(xué)技術(shù)12 免疫組化操作步驟免疫組織化學(xué)技術(shù)13 免疫組化操作步驟免疫組織化學(xué)技術(shù)13一.石蠟切片制作1、固定

4、：取組織，用PBS沖洗，放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液內(nèi)固定12h2、脫水：倒去固定液，用蒸餾水沖洗3次，再用50%酒精沖洗2次，用酒精逐級脫水，70%酒精1天，80%酒精過夜，95%酒精3h，無水酒精（）、（）各2h3、透明：1:1無水酒精二甲苯45min，二甲苯（）、（）各30min4、包埋：（恒溫箱內(nèi)進(jìn)行）浸入石蠟，1:1二甲苯石蠟（58）45min，石蠟（）、（）、（）共2.5h，用石蠟（）包埋組織免疫組織化學(xué)技術(shù)14一.石蠟切片制作1、固定：取組織，用PBS沖洗，放入4%多聚5、切片：包埋后的組織塊經(jīng)修整后，用切片機(jī)切成5-7m，的石蠟帶6、貼片：將組織石蠟塊在50溫水中展片，然后用處

5、理干凈的載玻片撈片，組織帶可黏在載玻片上 （洗片：1%HCl浸泡過夜、蒸餾水沖洗、95%酒精浸泡2h后擦干 涂膠：防脫劑多聚賴氨酸）7、烤片：68恒溫箱內(nèi)烤片2h免疫組織化學(xué)技術(shù)155、切片：包埋后的組織塊經(jīng)修整后，用切片機(jī)切成5-7m，的二.SP（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)）三步法染色步驟1、脫蠟、水化 6020分鐘二甲苯2 10分鐘100%的絕對乙醇:25分鐘;95% ethanol 2 minutes；95%的乙醇2分鐘80% ethanol 2 minutes；70% ethanol 2 minutes；distilled water:5 min；蒸餾水:5分鐘PBS洗3次3

6、min。免疫組織化學(xué)技術(shù)16二.SP（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)）三步法染色步驟2、阻斷：3%H2O2去離子水（或80%甲醇）孵育10min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性3、PBS沖洗2-3次，每次5min4、抗原修復(fù)：置0.01M枸櫞酸緩沖液（PH 6.0）中用煮沸（95，15-20min），自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫5、PBS沖洗2-3次，每次5min6、封閉：滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20min，甩去多余液體7、滴加抗50l，室溫靜置1h，或者371h，或者4過夜（需在37復(fù)溫45min）8、PBS沖洗2-3次，每次5min免疫組織化學(xué)技術(shù)172

7、、阻斷：3%H2O2去離子水（或80%甲醇）孵育10min9、滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗4050l，室溫靜置1h，或371h10、PBS沖洗2-3次，每次5min11、滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或37孵育30min-1h12、PBS沖洗2-3次，每次5min13、顯色：DAB顯色5-10min，在顯微鏡下掌握染色程度（胞漿呈棕色者判定為陽性細(xì)胞）（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻）（A：DAB B：H2O2 C：磷酸緩沖液）免疫組織化學(xué)技術(shù)189、滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗4050l，室溫靜置1h14、自來水沖洗10

8、分鐘終止反應(yīng)15、復(fù)染：蘇木精復(fù)染2min，鹽酸酒精分化16、自來水沖洗10-15min17、常規(guī)脫水 50% ethanol 1-2 min， 70% ethanol 1-2 min 95% ethanol 1-2 min； 95% ethanol 1-2 min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。 透明：Xylene 1(1-2) minXylene 2(1-2) min 封片（用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上）、鏡檢免疫組織化學(xué)技術(shù)1914、自來水沖洗10分鐘終止反應(yīng)免疫組織化學(xué)技術(shù)19三.二步法免疫組化染色步驟二甲苯脫蠟，梯度酒精置換二甲苯PBS

9、沖洗3次，每次3分鐘根據(jù)每一種抗體的要求，對組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù) 0.3%過氧化氫甲醇液阻斷20分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性PBS沖洗、浸泡5分鐘，3次正常山羊血清室溫封閉10分鐘免疫組織化學(xué)技術(shù)20三.二步法免疫組化染色步驟二甲苯脫蠟，梯度酒精置換二甲苯免疫甩去血清，加入適當(dāng)稀釋的一抗，37孵育60分鐘或4過夜PBS沖洗，浸泡5分鐘，3次滴加多聚螯合物，37孵育30分鐘PBS沖洗，浸泡5分鐘，3次新鮮配置酶底物顯色液DAB顯色310分鐘流水沖洗蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。顯微鏡觀察拍照IPP軟件分析光密度免疫組織化學(xué)技術(shù)21甩去血清，加入適當(dāng)稀釋的一抗，37孵育60分鐘或4過夜免幾

10、種抗原修復(fù)方法真空負(fù)壓抗原修復(fù)法：切片脫蠟至水。0.3%H2O2甲醇真空負(fù)壓處理5分鐘。自來水洗，蒸餾水洗。0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0），真空負(fù)壓干燥箱預(yù)先調(diào)至95，真空負(fù)壓處理10分鐘。待修復(fù)注降至室溫的一，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。免疫組織化學(xué)技術(shù)22幾種抗原修復(fù)方法真空負(fù)壓抗原修復(fù)法：切片脫蠟至水。0微波輻射抗原修復(fù)法：切片脫蠟至水。0.3%H2O2甲醇處理10分鐘。自來水洗，蒸餾水洗。0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0），于微波爐內(nèi)微波輻射10分鐘，如檢測Er和Pr則需要20輻射分鐘左右。待修復(fù)液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學(xué)的

11、染色方法進(jìn)行染色。免疫組織化學(xué)技術(shù)23微波輻射抗原修復(fù)法：切片脫蠟至水。0.3%H2O2甲高壓抗原修復(fù)法：切片脫蠟至水。0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。自來水洗，蒸餾水洗。切片放入抗原修復(fù)液中，邊同容器放入高壓鍋中加熱至沸騰。蓋上壓力閥至噴汽后持續(xù)14分鐘。待修復(fù)液恢復(fù)至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學(xué)染色方法進(jìn)行染色。免疫組織化學(xué)技術(shù)24高壓抗原修復(fù)法：切片脫蠟至水。0.3%H2O2甲醇處電爐加熱抗原修復(fù)法：切片脫蠟至水。0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。自來水洗，蒸餾水洗。將切片放入抗原修復(fù)液中于電爐上加熱，不時(shí)用溫度計(jì)測量溫度，當(dāng)達(dá)92后，即可拔離電源，當(dāng)溫度低于

12、92時(shí)，再插上電源，如此反復(fù)持續(xù)至10分鐘左右。待抗原修復(fù)液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選定的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。免疫組織化學(xué)技術(shù)25電爐加熱抗原修復(fù)法：切片脫蠟至水。0.3%H2O2甲胰蛋白酶消化法：切片脫蠟至水。0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。自來水洗，蒸餾水洗。PBS洗3次，1分鐘/次。滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，處理切片20分鐘左右。PBS洗3次，2分鐘/次。后按選好的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。免疫組織化學(xué)技術(shù)26胰蛋白酶消化法：切片脫蠟至水。0.3%H2O2甲醇處 所用試劑1.PBS：0.01M磷酸鹽緩沖液 (pH7.4) 配制 - 取NaCl 8g，KCl 0.2

13、g，Na2HPO412H2O 3.63g或Na2HPO4 1.44g， KH2PO4 0.24g，溶于900ml雙蒸水中，用鹽酸調(diào)pH值至7.4，加水定容至1L，常溫保存?zhèn)溆?.包埋劑：石蠟3.防脫劑：多聚賴氨酸（PLL5g+蒸餾水1000ml）、APES（3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷）免疫組織化學(xué)技術(shù)27 所用試劑1.PBS：0.01M磷酸鹽緩沖4.固定液：4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(pH7.4) 配制 a.0.1M磷酸鹽緩沖液：取A液400ml與B液80ml混合后，調(diào)pH于7.4，再定容至500ml A液：0.1mol/L Na2HPO4（Na2HPO412H2O 35.8g加水定容至100

14、0ml） B液：0.1mol/L NaH2PO4（NaH2PO42H2O 15.6g加水定容至1000ml） b.4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液：取20g多聚甲醛溶于500ml 0.1M磷酸鹽緩沖液中，加熱并攪拌約2-3h后溶解5.細(xì)胞通透液：由終濃度分別為0.3%雙氧水和0.3%Triton X-100（曲拉通X-100 又稱清潔劑）混合而成。配制方法是先用微波加熱的36 ml PBS，再接著加120 ul TritonX-100，并加熱一會(huì)兒，冷卻至臨用前加0.4 ml 30H2O2。免疫組織化學(xué)技術(shù)284.固定液：4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(pH7.4)免疫組織化6.抗原修復(fù)液：0.01M枸櫞酸

15、緩沖液（PH 6.0），或0.01M檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0） 配制 - 取A液8ml與B液42ml混合后加水至400ml，調(diào)pH于6.0，再定容至500mlA液：0.1mol/L 檸檬酸（C6H8O7H2O 21.01g加水定容至1000ml）B液：0.1mol/L 檸檬酸鈉（Na3C6H5O72H2O 29.41g加水定容至1000ml）7. 5羊血清或封閉血清，用PBS稀釋。含0.03H2O2的0.05DAB二氨基聯(lián)苯胺 （避光）：用20DAB（1，10 mg/ml）5 ul0.1 ul 30% H2O295 ul PBS。8.一抗（特異結(jié)合底物1:100） 、二抗均用PBS稀釋。9.

16、二甲苯、梯度酒精（1002、95、80、70、50）、雙蒸水、中性樹膠（封裱劑）。10.顯色劑：DAB試劑盒、蘇木素染液免疫組織化學(xué)技術(shù)296.抗原修復(fù)液：0.01M枸櫞酸緩沖液（PH 6.0），或0免疫組化結(jié)果的判斷原則1、每批染色都要有特異性陽性對照和陰性對照為基礎(chǔ)，才能對染色結(jié)果做判斷；2、陽性表達(dá)必須在細(xì)胞和組織特定的抗原部位才能視 為陽性；3、陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)，即陰性結(jié)果無判斷意義；陽性結(jié)果有強(qiáng)弱、多少之分，哪怕一個(gè)細(xì)胞陽性，只要是在抗原所表達(dá)部位，也有診斷意義。4、當(dāng)免疫組化結(jié)果與HE切片診斷有矛盾時(shí)，以HE切片診斷為準(zhǔn)。5、應(yīng)用“反正法”確保免疫組化在診斷中的準(zhǔn)確性。6

17、、避免假陰性和假陽性的發(fā)生。免疫組織化學(xué)技術(shù)30免疫組化結(jié)果的判斷原則1、每批染色都要有特異性陽性對照和陰性 免疫組化的應(yīng)用范圍在常規(guī)病理診斷中應(yīng)用免疫組化主要有8個(gè)方面：1、對腫瘤的組織起源進(jìn)行鑒別診斷；2、對腫瘤的良惡性進(jìn)行綜合判斷；3、發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶；4、激素受體的檢測以指導(dǎo)臨床治療；5、激素類細(xì)胞的定性和定位，以明確內(nèi)分泌 細(xì)胞的類型和功能狀態(tài)。6、指導(dǎo)腫瘤預(yù)后，如PgP、CerbB-2、P53等。7、指導(dǎo)腫瘤分期；8、免疫性疾病的輔助診斷，如腎小球腎炎、某些皮膚疾病等組織內(nèi)免疫復(fù)合物的檢測。免疫組織化學(xué)技術(shù)31 免疫組化的應(yīng)用范圍在常規(guī)病理診斷中應(yīng)用免疫組化免疫組化染色中的常見問題及

18、對策 免疫組化操作方法比較簡單，然而在實(shí)際工作中也會(huì)遇到一些麻煩，如脫片、無特異性表達(dá)或表達(dá)較弱、染色過強(qiáng)、背景染色強(qiáng)、定位不好等。引起上述問題的原因較多，主要有組織固定、脫水不良或浸蠟溫度過高導(dǎo)致抗原丟失；抗原未修復(fù)；抗體或工作液失效、抗體稀釋不當(dāng)；在一定溫度下抗原孵育時(shí)間不足、一抗和二抗不匹配；顯色劑失效或配置方法失誤等。因此，良好的組織固定和脫水及適當(dāng)?shù)慕灉囟仁亲龊妹庖呓M化的前提。中性福爾馬林固定有利于正確結(jié)果的顯示。免疫組織化學(xué)技術(shù)32免疫組化染色中的常見問題及對策 免疫組化操作方法比較簡單，1、脫片的可能原因與對策整批切片脫片可能是載玻片未處理，玻片上有油污未清洗或未涂抹防脫片膠，

19、或烤片時(shí)間不足致粘片不牢固。單張切片及整塊組織脫片除了上述原因外，需考慮抗體熱修復(fù)時(shí)液體溫度過高和時(shí)間過長，或沖洗時(shí)用力過猛等因素。免疫組織化學(xué)技術(shù)331、脫片的可能原因與對策整批切片脫片免疫組織化學(xué)技術(shù)332、無特異性表達(dá)的原因 問 題確認(rèn)染色過程次序是否正確；是否忽略了某一過程；是否孵育了足夠的時(shí)間；是否使用了正確的抗體，以及二抗是否和一抗一致匹配。底物顯色系統(tǒng)是否失效。 解 決 方 法重新實(shí)驗(yàn)，設(shè)立陽性對照，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果；仔細(xì)確定一抗與二抗種屬；更換顯色劑（DAB或AEC）;不得使用過期試劑盒，不同批號試劑盒不能混用；免疫組織化學(xué)技術(shù)342、無特異性表達(dá)的原因 問 題 3、表達(dá)較弱 問

20、 題標(biāo)本固定方式不當(dāng)或固定時(shí)溫度過高，使部分組織抗原被破壞；抗原修復(fù)方式不當(dāng)；抗體濃度過低，或者孵育的溫度、時(shí)間不夠； 沖洗后切片殘留多余緩沖液。如果陰性對照沒有反應(yīng)，陽性對照反應(yīng)良好，而標(biāo)本弱陽性，應(yīng)考慮查標(biāo)本本身原因。 解 決 方 法新鮮組織及時(shí)固定，防止自溶，固定時(shí)間不超過24小時(shí)；封閉時(shí)間不超過10分鐘，或參考產(chǎn)品說明；注意復(fù)染時(shí)間提高抗體濃度，孵育時(shí)間不少于60分鐘（室溫低于15，改在37 溫箱孵育或4 冰箱過夜）免疫組織化學(xué)技術(shù)353、表達(dá)較弱 問 題 4、染色過強(qiáng) 問 題抗體濃度過高或孵育時(shí)間過長孵育溫度過高，37顯色速度過快或顯色時(shí)間過長； 解 決 方 法降低抗體濃度、孵育時(shí)間

21、；室溫1小時(shí)或4過夜；縮短顯色時(shí)間；顯色時(shí)間不超過510分鐘，以顯微鏡下觀察為準(zhǔn)；免疫組織化學(xué)技術(shù)364、染色過強(qiáng) 問 題 解 決 方 法5、非特異性背景染色 問 題操作過程中沖洗不充分；加試劑后切片干燥；組織切片折疊；組織中含過氧化物酶未阻斷；組織中含內(nèi)源性生物素；組織抗原彌散；切片粘附劑過厚；血清蛋白封閉不充分； 解 決 方 法每步?jīng)_洗35；防止切片干燥（必要時(shí)重做）勿以折疊處觀察染色結(jié)果；可配置新鮮3%雙氧水封閉，孵育時(shí)間延長；正常非免疫動(dòng)物血清再封閉；組織及時(shí)固定，固定液要合標(biāo)準(zhǔn)重新配置粘附劑涂液；延長血清封閉時(shí)間；免疫組織化學(xué)技術(shù)375、非特異性背景染色 問 題 免疫組織化學(xué)技術(shù)培訓(xùn)課件7、封片時(shí)的注意事項(xiàng)封片時(shí)動(dòng)作快切片入二甲苯后起白霧，為脫水未盡記住切片的組織面防脫片處理蓋片必須大于組織塊封固劑不要滴得太多，也不要太少，防止氣 泡產(chǎn)生。免疫組織化學(xué)技術(shù)397、封片時(shí)的注意事項(xiàng)封片時(shí)動(dòng)作快免疫組織化學(xué)技術(shù)39注意事項(xiàng)一、抗體的保存 濃縮抗體：有效期內(nèi)，只需