實驗二十五sds聚丙烯酰胺凝膠電泳

1、實驗二十五SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量、目的要求1、掌握SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法的原理。2、穩(wěn)固垂直板電泳的根本操作。3、學(xué)會用該方法測定蛋白質(zhì)的相對分子量。二、原理聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高分辨率，用它別離、檢測蛋白質(zhì)混合樣品，主要是根據(jù)各蛋白質(zhì)組分的分子大小和形狀以及所帶凈電荷多少等因素所造成的電泳遷移率的差異。1967年，Shapir。等人發(fā)現(xiàn)，在聚丙烯酰胺凝膠中參加十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate,SDS)后，與SDS結(jié)合的蛋白質(zhì)帶有一致的負電荷，電泳時其遷移速率主要取決于它的Mr(相對分子質(zhì)量)，而與所帶電荷和形狀無關(guān)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的Mr在

2間時，蛋白質(zhì)的Mr與電泳遷移率間的關(guān)系可用下式表示：lgMr=K-bm圖137種蛋白質(zhì)的Mr對數(shù)與電泳相對遷移率關(guān)系圖Mr范圍為1100070000,10%凝膠，pH=7.2,SDS-磷酸鹽緩沖系統(tǒng)式中，Mr為蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量；m為遷移率；b為斜率；K為截距。均為常數(shù)。在條件一定時，b和K將相對分子質(zhì)量的標準蛋白質(zhì)的遷移率對Mr的對數(shù)作圖，可得到一條標準曲線（如圖1）。將未知相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)樣品，在一樣的條件下進展電泳，根據(jù)它的電泳遷移率可在標準曲線上查得它的相對分子質(zhì)量。SDS是一種陰離子型去污劑，在蛋白質(zhì)溶解液中參加SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇可使蛋白質(zhì)分子

3、中的二硫鍵復(fù)原；SDS能使蛋白質(zhì)的非共價鍵（氫鍵、疏水鍵）翻開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上（在一定條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合比為1.4gSDS/g蛋白質(zhì)），形成蛋白質(zhì)一SDS復(fù)合物。由于SDS帶有大量負電荷，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合時，所帶的負電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因此掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差異。SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物的流體力學(xué)和光學(xué)性質(zhì)說明，它們在水溶液中的形狀，近似于雪茄煙形的長橢圓棒。不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長度都一樣，而長軸那么隨蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小成正比地變化。這樣的蛋白質(zhì)一SDS復(fù)合物在凝膠中的遷移率，不

4、再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只是橢圓棒的長度，也就是蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的函數(shù)。SDS緩沖系統(tǒng)有連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)。不連續(xù)SDS緩沖系統(tǒng)有較好的濃縮效應(yīng)，近年趨向用不連續(xù)SDS緩沖系統(tǒng)。按所制成的凝膠形狀又有垂直板型電泳和垂直柱型電泳。本實驗采用SDS-不連續(xù)系統(tǒng)垂直板型凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。三、試劑與器材一、試劑標準蛋白質(zhì)純品：根據(jù)待測蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量大小，選擇46種相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)純品作為標準蛋白質(zhì)。本實驗采用的標準蛋白質(zhì)見表1所示。表15種標準蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量標準蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量（道爾頓）雞蛋清溶菌酶14400胰蛋白酶抑制劑21100牛碳酸酐酶31000卵

5、清蛋白43000牛血清清蛋白67000兔磷酸化酶B970001%（V/V）TEMED溶液：取1mlTEMED，加蒸餾水至100ml,置于棕色瓶中，在4C冰箱中保存。10%（W/V）過硫酸銨溶液：取過硫酸銨1g，溶解于10ml蒸餾水中。最好現(xiàn)配現(xiàn)用。0.05molL-1，pH=8.0Tris-HCI緩沖溶液：稱取Tris，參加50ml蒸餾水使之溶解,再參加3mllmolL-1HCl溶液，混勻后在pH計上調(diào)pH至8.0,最后加蒸餾水定容至100ml。蛋白質(zhì)樣品溶解液:SDS100mg，巰基乙醇0.1ml，甘油1.0ml,溴酚藍2mg，Tris-HCl緩沖溶液2ml，加蒸餾水至總體積10ml。別離膠

6、緩沖溶液:Tris36.3g，參加1molL-1HCl溶液48.0ml，再加蒸餾水到100ml,pH=8.9。濃縮膠緩沖溶液：Tris，加1molL-1凝膠貯液：Acr,Bis，加蒸餾水到100ml電極緩沖溶液：SDSlg,Tris6g,甘氨酸，加蒸餾水至1000ml,pH=8.3。固定液：取50%甲醇454ml,冰醋酸46ml,混勻。染色液：1.25g考馬斯亮藍R-250,加454ml50%甲醇溶液和46ml冰醋酸，混勻。脫色液：取冰醋酸75ml，甲醇50ml，加蒸餾水875ml。二、器材垂直板型電泳槽直流穩(wěn)壓電源（電壓300600V,電流50100mA）50或100ul的微量注射器四、操作

7、步驟一、安裝垂直板型電泳裝置此種夾心式垂直板電泳裝置（如圖2,3）的兩側(cè)為有機玻璃制成的電極槽，兩個電極槽中間夾有一個凝膠模子。凝膠模子由3部分組成；一個“U形的硅膠框、兩塊長短不等的玻璃片、樣品槽模板（俗稱“梳子）。電極槽由上貯槽（白金電極在上或面對短玻璃片）、下貯槽（白金電極在下或面對長玻璃片）和冷凝系統(tǒng)組成。凝膠模子的硅膠框內(nèi)側(cè)有兩條凹槽，可將兩塊相應(yīng)大小的玻璃片嵌入槽內(nèi)。玻璃片之間形成一個23mm厚的間隙，將來制膠時，將膠灌入其中。灌膠前，先將玻璃片洗凈、晾干、嵌入膠帶凹槽中。長玻璃片下沿與膠帶框底之間保持有一縫隙，以使此端的凝膠與一側(cè)的電極槽相通；而短玻璃片的下沿那么插入橡膠框的底槽

8、內(nèi)。將已插好玻璃片的凝膠模子置于仰放的上貯槽上，短玻璃片應(yīng)面對上貯槽，再合上下貯槽，用4條長螺絲將兩個半槽固定在一起。上螺絲時，要按一定順序逐個擰緊，均勻用力。將裝好的電泳裝置垂直放置，在長玻璃片下端與硅膠框交界的縫隙內(nèi)參加用電極緩沖溶液配制的1%瓊脂糖溶液，待其凝固后，即堵住凝膠模板下面的窄縫（通電時又可作為鹽橋）。二、凝膠的制備別離膠的制備根據(jù)所測蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量范圍，選擇某一適宜的別離膠濃度。按表2所列的試劑用量配制。將所配制的凝膠液沿著凝膠的長玻璃片的內(nèi)面用細長頭的滴管加至長、短玻璃片的窄縫內(nèi)，加膠高度距樣品槽模板下緣約1cm。用滴管沿玻璃片內(nèi)壁加一層蒸餾圖2夾心式垂直板型電泳槽示

9、意圖1導(dǎo)線接頭2下貯槽3.U形橡膠框4樣品槽模板5固定螺絲6.上貯槽7冷凝系統(tǒng)圖3凝膠模子示意圖1樣品槽模板2長玻璃片3短玻璃片4.U形硅膠框表2SDS-不連續(xù)系統(tǒng)不同濃度凝膠配制用量表貯液配制30ml不同濃度的別離膠液所需試劑用量/ml配制10ml3%濃縮膠/ml7%10%12%15%20%凝膠貯液10121520別離膠緩沖溶液凝膠貯液-1濃縮膠緩沖溶液-10%SDS溶液1%TEMED溶液222222蒸餾水131085-以上溶液混合后抽氣10分鐘10%過硫酸銨溶液水（用于隔絕空氣，使膠面平整）。約3060分鐘凝膠完全聚合，用滴管吸去別離膠膠面的水封層，并用無毛邊的濾紙條吸去殘留的水液。2濃縮

10、膠的制備按表2配制濃縮膠，混勻后用細長頭的滴管將凝膠溶液加到已聚合的別離膠上方，直至距短玻璃片上緣0.5cm處，輕輕將“梳子插入濃縮膠內(nèi)插入“梳子的目的是使膠液聚合后，在凝膠頂部形成數(shù)個互相隔開的凹槽。約30分鐘后凝膠聚合，再放置30分鐘。小心拔去“梳子，用窄條濾紙吸去樣品凹槽內(nèi)多余的水分。三蛋白質(zhì)樣品的處理1標準蛋白質(zhì)樣品的處理稱標準蛋白質(zhì)樣品各1mg左右，分別轉(zhuǎn)移至帶塞的小試管中，按1.01.5g/L溶液比例，向樣品參加樣品溶解液，溶解后輕輕蓋上蓋子（不要蓋緊，以免加熱時迸出），在100C沸水浴中保溫23分鐘，取出冷至室溫。如處理好的樣品暫時不用，可放在20C冰箱保存較長時間。使用前在10

11、0C水中加熱3分鐘，以除去可能出現(xiàn)的亞穩(wěn)態(tài)聚合物。2待測蛋白質(zhì)樣品的處理固體樣品的處理與標準蛋白質(zhì)一樣。如待測樣品已在溶液中，可先配制“濃樣品溶解液（各種溶質(zhì)的濃度均比“樣品溶解液高1倍），將待測液與“濃樣品溶解液等體積混勻，然后同上加熱。如待測液太稀可事先濃縮，假設(shè)含鹽量太高那么需先透析。四加樣將pH=8.3的電極緩沖溶液倒入上、下貯槽中，應(yīng)沒過短玻璃片。用微量注射器依次在各個樣品凹槽內(nèi)加樣，一般加樣體積為1015/卩1。如樣品較稀，可加2030/ulo由于樣品溶解液中含有比重較大的甘油，故樣品溶液會自動沉降在凝膠外表形成樣品層。五電泳將上槽接負極，下槽接正極，翻開電源，開始時將電流控制在1

12、520mA,待樣品進入別離膠后，改為3050mA。待藍色染料遷移至下端約1時，停頓電泳，約需56小時。六固定取下凝膠模子，將凝膠片取出，滑入一白瓷盤或大培養(yǎng)皿內(nèi)，在染料區(qū)帶的中心插入細銅絲作為標志。參加固定液（應(yīng)沒過凝膠片），固定2小時或過夜。七染色傾出固定液，參加染色液，染色過夜。八脫色染色完畢，傾出染色液，加人脫色液。數(shù)小時換一次脫色液，直至背景明晰，約需一晝夜。九Mr的計算通常以相對遷移率mr來表示遷移率。相對遷移率的計算方法如下：用直尺分別量出樣品區(qū)帶中心及銅絲與凝膠頂端的間隔如圖4，按下式計算：相對遷移率（mr）=樣品遷移間隔（cm）/染料遷移間隔（cm）。以標準蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的

13、對數(shù)對相對遷移率作圖，得到標準曲線（如圖1）。根據(jù)待測樣品的相對遷移率，從標準曲線上查出其相對分子質(zhì)量。ULfHULT圖4標準蛋白質(zhì)在SDS-凝膠上的別離示意圖a.樣品遷移間隔b.染料遷移間隔料-11細胞色素c2胰凝乳蛋白酶原A3胃蛋白酶1拉4卵清蛋白5牛血清清蛋白五、考慮題1、樣品溶解液中各種試劑的作用是什么？2、實驗否需要在低溫下進展？3、該方法是否能用于所有的蛋白質(zhì)相對分子量的測定？為什么？4、本實驗測得的分子量存在誤差，根據(jù)你的實驗分析造成誤差產(chǎn)生的原因。實驗二十五SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量習(xí)題一、單項選擇題1在聚丙烯酰胺凝膠中參加以下那個成分后，蛋白質(zhì)帶有一致的

14、負電荷，電泳時其遷移速率主要取決于它的Mr（相對分子質(zhì)量），而與所帶電荷和形狀無關(guān)。A.EDTAB.尿素C.亞精胺D.SDS2以下那個試劑具有復(fù)原性？A.二硫蘇糖醇BDEPCC.巰基乙醇D.TrisHCl在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中，以下那個試劑常用為指示劑？A.SDSB.巰基乙醇C.溴酚藍D.甘油當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量間時，蛋白質(zhì)的分子量的對數(shù)與電泳遷移率是什么關(guān)系？將未知相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)樣品，在一樣的條件下進展SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍染色后，根據(jù)它的電泳遷移率可在標準曲線上查得蛋白質(zhì)的那個信息？二、多項選擇題以下那些試劑是蛋白質(zhì)樣品溶解液的成分？A.

15、SDSB三氯乙酸C溴酚藍D磷酸二氫鈉在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中，脫色液和染色液共用的是那兩個試劑？SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，它們在水溶液中的形狀，不可能是以下那些形狀？在公式lgMr=K-bm中，作為常數(shù)的是：A.MrB.KC.bD.m5三、填空題在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中，電泳時其遷移速率主要取決于它的_，而與所帶電荷和形狀無關(guān)。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中，SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的長度都一樣，而那么隨蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小成正比地變化。SDS是一種離子型去污劑。由于SDS帶有大量_電荷，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合時，所帶的電荷量大大超過了蛋白

16、質(zhì)分子原有的電荷量，因此掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差異。蛋白質(zhì)樣品溶解液中，甘油的作用是。四、簡答題1、簡述SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的原理。2、在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中，試說明樣品溶解液中含有SDS、巰基乙醇、甘油、溴酚藍、和Tris-HCl各種試劑的作用是什么？3、在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中，當(dāng)SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，會引起蛋白質(zhì)構(gòu)象如何變化？該變化會有什么結(jié)果？參考答案一、單項選擇題1、D2、C3、C4、B5、D二、多項選擇題1、AC2、BC3、AB4、CD5、ACD三、填空題1.Mr（相對分子質(zhì)量）2短軸，長軸3.陰負協(xié)助蛋白質(zhì)沉淀四、簡答題1、簡述

17、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的原理。答案：在聚丙烯酰胺凝膠中參加十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate,SDS）后，與SDS結(jié)合的蛋白質(zhì)帶有一致的負電荷，電泳時其遷移速率主要取決于它的Mr（相對分子質(zhì)量），而與所帶電荷和形狀無關(guān)，在一定的分子量范圍內(nèi)，二者是種線性關(guān)系。這是因為SDS帶有大量負電荷，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合時大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合比為1.4gSDS/g蛋白質(zhì)所帶的負電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因此掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差異。2、在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中，試說明樣品溶解液中含有SDS、巰基乙醇、甘油、溴酚藍、和Tris-HCl各種試劑的作用是什么？答案：SDS：結(jié)合蛋白質(zhì)，消除蛋白質(zhì)間電荷差異，同時是一種變性劑；巰基乙醇：復(fù)原齊U;