重組結(jié)核分枝桿菌Mr 38 000蛋白的表達(dá)、純化和鑒定

1、重組結(jié)核分枝桿菌Mr 38 000蛋白的表達(dá)、純化和鑒定摘要從h37rv基因組中擴(kuò)增r38000蛋白基因并高效表達(dá)和純化。用pr技術(shù)從結(jié)核分枝桿菌h37rv基因組中擴(kuò)增r38000蛋白序列，將其與pge-t-easy載體連接轉(zhuǎn)化e.lidh5，構(gòu)建重組克隆載體pge-t-easy/r38000，測(cè)序正確后將目的基因片斷克隆入pqe-80l原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化e.lidh5，iptg誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。經(jīng)estern-blt鑒定目的基因與(his)6交融表達(dá)，將已表達(dá)的蛋白質(zhì)通過(guò)ni-nta親和色譜柱進(jìn)展純化。pr得到結(jié)核分枝桿菌r38000蛋白基因，測(cè)序結(jié)果與gebank中報(bào)道的完全一致。sds顯

2、示，在r為38.5103處有相應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶，esernblt鑒定為(his)6交融表達(dá)蛋白。經(jīng)ni-nta親和色譜柱進(jìn)展純化后可得到純化的蛋白。成功克隆了鐵調(diào)節(jié)蛋白基因r38000蛋白序列，并在e.lidh5高效表達(dá)，親和層析后獲得了純化目的蛋白。關(guān)鍵詞r38000蛋白;表達(dá);純化;結(jié)核分枝桿菌；lning,expressinandpurifiatinfr38000prteinfrybateriutuberulsiszhanging，lijin-heng，linhangkeyrdsr38000prtein;expressin;purifiatin;ybateriutuberulsis(t

3、b)結(jié)核分枝桿菌ybateriutuberulsis,tb是結(jié)核病(tuberulsis,tb)的病原體。其在患者體內(nèi)主要為細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)。診斷方法的欠缺是結(jié)核病流行的重要原因。目前常用的ppd試驗(yàn)，常使bg疫苗接種者被誤檢為陽(yáng)性1，且對(duì)后期結(jié)核患者敏感性較低，存在明顯缺乏。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)r38000蛋白具有強(qiáng)的免疫原性，而成為結(jié)核分枝桿菌抗原的研究熱點(diǎn)2,3，可能成為結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑和疫苗研究的候選抗原之一。為此，我們?cè)谠吮磉_(dá)載體中表達(dá)結(jié)核分枝桿菌r38000蛋白并對(duì)其進(jìn)展了純化，為進(jìn)一步研究其抗原性和主要功能提供方便。材料和方法1.1材料tb毒株h37rv、dh5由本室保存;pge-

4、t-easy及izardpluspurifiatinsyste購(gòu)自prega公司；x-gal，限制性內(nèi)切酶bah,er及t4-dna連接酶，taqdna聚合酶均為takara公司產(chǎn)品；iptg,dtt,dte,小量質(zhì)粒提取試劑盒均為siga公司產(chǎn)品，膠回收試劑盒為vitagene公司產(chǎn)品。1.2方法參加er酶切位點(diǎn)。引物由上海生工生物技術(shù)合成。改良羅氏培養(yǎng)基的tbh37rv接種于7h9液體培養(yǎng)基，37間或振蕩培養(yǎng)23k。取5l液體培養(yǎng)物的菌體沉淀重懸于50l裂解液中。于55水浴1h，沸水浴10in滅活蛋白酶k，離心取上清，用酚/氯仿抽提，無(wú)水乙醇沉淀，溶于50lte中，作為dna模板。pr反響

5、體系為：10buffer5l,dntps5l(2.5l/l)、dna模板為1l，p1，p2引物各1l(25l/l)及taq酶1l，加水至50l。pr條件：94變性40s，60復(fù)性30s，72延伸1.5in，30個(gè)循環(huán)。反響，轉(zhuǎn)化感受態(tài)dh5，均勻涂布于含有x-gal(33l)和異丙基-d硫代半乳糖苷iptg(20l)的lb培養(yǎng)皿中，37培養(yǎng)16h，挑取白色菌落進(jìn)展酶切鑒定，所獲陽(yáng)性克隆命名為pge-t-easy-r38000，送至上海生工生物工程進(jìn)展序列測(cè)定。反響，轉(zhuǎn)化感受態(tài)dh5，挑取的陽(yáng)性克隆命名為pqe-80l-r38000。在含有氨芐青霉素100g/l的lb培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)pqe-80

6、l-r38000。按10%的接種量進(jìn)展轉(zhuǎn)接，37搖菌3h，參加異丙基-d硫代半乳糖苷(iptg)至終濃度為0.5l/l，37繼續(xù)培養(yǎng)45h。取1.5l細(xì)菌培養(yǎng)物，8000g離心30s搜集菌體，參加2樣品緩沖液劇烈振蕩混勻，100,5in；8000g離心5in；取上清進(jìn)展sds電泳檢測(cè)。參加hrp標(biāo)記的羊抗鼠igg抗體，37孵育1h。pbs洗滌后dab顯色觀察結(jié)果。2結(jié)果2.1r38000蛋白片段的擴(kuò)增及序列測(cè)定經(jīng)30個(gè)循環(huán)pr擴(kuò)增，可得與預(yù)計(jì)長(zhǎng)度相等的片斷圖1。將dna回收后插入pge-t-easy載體，經(jīng)測(cè)序證實(shí)所擴(kuò)增的r38000序列與gebank數(shù)據(jù)庫(kù)所收錄的r38000序列完全一致。:

7、dnaarkerdl2000;1:r38000基因pr產(chǎn)物;圖1pr擴(kuò)增r38000蛋白基因產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳10g/l結(jié)果2.2表達(dá)載體的構(gòu)建pqe-80l經(jīng)bahi和er雙酶切后與r38000基因目的片斷進(jìn)展連接反響后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)e.lidh5。挑取的克隆子進(jìn)展酶切鑒定，切出約1151bp大小片段的為陽(yáng)性克隆子(圖2)，命名為pqe-80l-r38000。:dnaarkerdl2000;1,2:pqe-80lr38000;圖2pqe-80l-r38000重組質(zhì)粒bahi和er雙酶切鑒定結(jié)果2.3r38000蛋白在pqe-80l表達(dá)載體中的誘導(dǎo)表達(dá)將pqe-80l-r38000經(jīng)37活化過(guò)夜

8、，經(jīng)iptg誘導(dǎo)表達(dá)后做sds分析，從電泳圖中可以看出在r為38.5103一致處出現(xiàn)了一條表達(dá)帶，表達(dá)量約占菌體總蛋白的20%(圖3)。：蛋白分子量arker;1:未誘導(dǎo)的pqe-80l-r38000質(zhì)量重組菌e.lidh5;2-4:誘導(dǎo)的pqe-80l-r38000質(zhì)量重組菌e.lidh5;圖3(his)6-r38000交融蛋白的sds分析2.4目的蛋白的鑒定所構(gòu)建的重組質(zhì)粒表達(dá)的r38000蛋白以帶有6個(gè)組氨酸的交融蛋白的形式出現(xiàn)，使用鼠抗(his)6ab驗(yàn)證r38000蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示在r為38.5103處有一顯色帶，而對(duì)照無(wú)相應(yīng)條帶(圖4)。：蛋白分子量arker;1:(his)6

9、-r38000prteinexpressin2.dh5圖4(his)6-r38000交融蛋白的esternblt分析結(jié)果2.5目的蛋白的可溶性分析將上清和沉淀分別所制樣品，進(jìn)展sds分析說(shuō)明表達(dá)產(chǎn)物主要在細(xì)菌裂解后的沉淀中，而上清中那么很少(圖5)。：蛋白分子量arker;1:未誘導(dǎo)的pqe-80l-r38000質(zhì)量重組菌e.lidh5；2：誘導(dǎo)菌超聲裂解后沉淀;3:誘導(dǎo)菌超聲裂解后上清;圖5(his)6-r38000交融蛋白的可溶性分析2.6目的蛋白的純化純化的產(chǎn)物經(jīng)sds分析可在r為38.5103處得到一條明晰的條帶(圖6)。：蛋白分子量arker;1:未誘導(dǎo)的pqe-80l-r38000

10、質(zhì)量重組菌e.lidh5;2:誘導(dǎo)的pqe-80l-r38000質(zhì)量重組菌e.lidh5;3,4:(his)6-r38000純化蛋白圖6(his)6-r38000交融蛋白的表達(dá)及純化3討論r38000蛋白是一種磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，含有對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異單克隆抗體定位的7個(gè)表位，具有較強(qiáng)的抗原性，已經(jīng)得到了結(jié)核病研究學(xué)者們的一致認(rèn)可。1992年，bthaley4等認(rèn)為r38000蛋白是研究菌陰性肺結(jié)核最有用的抗原之一。2022年ark5等通過(guò)蛋白質(zhì)基因芯片和病人血清挑選，發(fā)現(xiàn)r38000蛋白是空洞性肺結(jié)核所特有的蛋白抗原。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的pqe-80l表達(dá)載體為4751bp，起始碼下游接有6個(gè)組氨酸，

11、雙鏈環(huán)狀，ap抗性，多克隆位點(diǎn)有17個(gè)單一限制性酶切位點(diǎn)。pr產(chǎn)物共有約1150bp，與r38000蛋白基因大小相符合。r38000克隆入pqe-80l載體中與6個(gè)組氨酸交融，可產(chǎn)生共約390個(gè)氨基酸的交融蛋白，r為38.5103左右，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論值相符合。交融蛋白有(his)6的表達(dá)，因此通過(guò)檢測(cè)組氨酸的表達(dá)，可間接證明r38000蛋白表達(dá)，同時(shí)(his)6的表達(dá)為進(jìn)一步純化蛋白提供了親和位點(diǎn)，它可與ni+特異性結(jié)合，通過(guò)ni-nta親和色譜柱可得到純化的目的蛋白。我們?cè)谠吮磉_(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)結(jié)核分枝桿菌的r38000蛋白，并進(jìn)展了初步鑒定和純化，為下一步深化研究r38000蛋白的功能奠定

12、了基矗參考文獻(xiàn)1brittnj,palengira.iprvingvainesagainsttuberulsisj.iunalellbil,2022:81(1):3445.2rldhealthrganizatinglbaltuberulsisntrl-surveillane,planning,finaning,hrept2022,rldhealthriganizatin,gengeva.3laals,skeikyya.iune-basedethds,intuberulsisandthetuberlebaillusj.aeriansietyfrirbilgypress,ashingtn,d.2022,7183.4bthaleygh,rrudd,ffestenstein.linialvalueftheeasureentfybateriutuberusisspeifiantibdyinpulnarytuberulsis