顯微鑒別法操作規(guī)程

1、第第 頁(yè)共9頁(yè)文件編號(hào)顯微鑒別法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程頒發(fā)部門總頁(yè)數(shù)執(zhí)行日期9編制者審核者批準(zhǔn)者編制日期審核日期批準(zhǔn)日期內(nèi)容：顯微鑒別法：系指用顯微鏡對(duì)藥材或飲片的切片、粉末、解離組織或表面制片及含飲片粉末的制劑中飲片的組織、細(xì)胞或內(nèi)含物等特征進(jìn)行鑒別的一種方法。儀器和用具儀器生物光學(xué)顯微鏡、顯微描繪器、滑走切片機(jī)、小型粉碎機(jī)或徒手圓筒生物切片器、鏡臺(tái)測(cè)微尺、離心機(jī)。用具放大鏡、刀片、解剖刀、鑷子（包括粗鑷及眼科彎鑷與直鑷）、剪（眼科剪與手術(shù)剪）、解剖針。載玻片、蓋玻片吸濕器（即玻璃干燥器改裝蒸餾水加微量苯酚，潮氣潤(rùn)濕藥材樣品用）、培養(yǎng)皿或小燒杯（放切片用，切片后的處理均可在其中進(jìn)行）、酒精燈、鐵三角架

2、、石棉網(wǎng)、滴瓶、試管、試管架、滴管、玻璃棒（粗與細(xì)）、乳缽、量筒等毛筆（從刀上刷取切片用）、鉛筆（HB、3H、6H繪圖用）、帶蓋搪瓷盤（裝切片標(biāo)本用）、紗布、吸水紙（濾紙）、火柴等。試藥與試液水合氯醛試液取水合氯醛50g,加水15ml與甘油10ml使溶解，即得。此液為透化劑，可使干縮的細(xì)胞壁膨脹而透明，并能溶解淀粉粒、樹(shù)脂、蛋白質(zhì)及揮發(fā)油等。甘油醋酸試液（斯氏液）取甘油、冰醋酸與水各等份，混合即得。此液專用于觀察淀粉形態(tài)，可使淀粉不膨脹變形，便于測(cè)量其大小。甘油-乙醇溶液取甘油1份，50%乙醇1份，混合即得。此液為封藏液，用于保存植物材料及臨時(shí)切片，有軟化組織的作用。蘇丹ni試液取蘇丹nio.

3、oig,加90%乙醇5ml溶解后，加甘油5ml,搖勻即得。本液應(yīng)置棕色玻璃瓶?jī)?nèi)保存，在2個(gè)月內(nèi)應(yīng)用。此液可使木栓化、角質(zhì)化細(xì)胞壁及脂肪油、揮發(fā)油、樹(shù)脂等染成紅色或淡紅色。釕紅試液取10%醋酸鈉溶液12ml,加釘紅適量使呈酒紅色即得。本液應(yīng)臨用新制。此液可使粘液染成紅色。間苯三酚試液取間苯三酚1g,加90%乙醇100ml使溶解，濾過(guò)即得。應(yīng)置棕色玻璃瓶?jī)?nèi)，在暗處保存。此液與濃鹽酸合用,可使木化細(xì)胞壁染成紅色或紫紅色。碘試液取碘化鉀0.5g,溶于少量水中，加碘1g,使溶解，加水至100ml即得。應(yīng)用時(shí)能常再加水稀釋成淡棕色或淡黃色。本液應(yīng)置棕色瓶?jī)?nèi)保存。此液用于檢查淀粉,染成藍(lán)色或紫色；蛋白質(zhì)或糊

4、粉粒呈黃色。硝鉻酸試液取硝酸10山1,加入100ml水中，混勻。另取鉻酸10g,加水100ml使溶解。用時(shí)將二液等量混合,即得。此液為常用的“植物組織解離液”。檢品的解離浸泡時(shí)間,按材料的質(zhì)地不同而異。a-萘酚試液取15%的a-萘酚乙醇溶液10.5ml,緩緩加入硫酸6.5ml,混勻后再另加乙醇40.5ml及水4ml,混勻即得。此液用于檢查菊糖，染成紫紅色，并很快溶解。硝酸汞試液（米隆氏試液）取汞4.5g,加發(fā)煙硝酸3ml,俟作用完畢，加等量水稀釋即得。本液應(yīng)置棕色玻璃塞瓶?jī)?nèi),在暗處保存。此液用于檢查糊粉粒,染成磚紅色。氯化鋅碘試液取碘化鉀8g,加水8.5ml使溶解，再加無(wú)水氯化鋅2.5g使溶解

5、，加碘適量至飽和，即得。本液應(yīng)置棕色玻璃塞瓶?jī)?nèi)。此液用于檢查木質(zhì)化與纖維素細(xì)胞壁,前者顯黃棕色,后者顯藍(lán)色或紫色。顯微標(biāo)本的制作切片制作標(biāo)本片（橫切或縱切）藥材的預(yù)處理先將藥材表面泥沙刷洗干凈，將應(yīng)觀察的部位，切成適當(dāng)大小的塊或段，一般以寬1cm、長(zhǎng)3cm為宜，切面削平整。質(zhì)地軟硬適中的藥材可直接進(jìn)行切片；質(zhì)地堅(jiān)硬的則須先使其軟化后再切片。軟化方法可放在吸濕器（即玻璃干燥器底部盛蒸餾水并滴數(shù)滴苯酚防霉，上部瓷板上置藥材樣品吸濕）中悶潤(rùn)，或在水中浸軟或煮軟。有些根、根莖、莖及木類藥材或飲片，質(zhì)地較堅(jiān)實(shí)，可將削平的切面浸水中片刻，待表面潤(rùn)濕時(shí)取出，直接切片也能切成較完整的薄片。過(guò)于柔軟的樣品，可將

6、其浸入70%95%乙醇中，約20分鐘后可變硬些，即可進(jìn)行切片。對(duì)于細(xì)小、柔軟而薄的藥材或飲片，如種子或葉片，不便直接手持切片，可用胡蘿卜、土豆、軟木塞或橡皮等作夾持物。將夾持物一側(cè)切一窄縫，將樣品嵌入其中，葉類藥材或飲片可用質(zhì)地松軟的通草或向日葵的莖髓作夾持物。新鮮樣品則直接進(jìn)入石蠟中，使樣品外面包上一層石蠟，再切片。藥材和飲片預(yù)處理時(shí)，應(yīng)注意不能影響要觀察的顯微鑒別特征。如要觀察菊糖、粘液等在軟化、切片、裝片等過(guò)程中，均不可與水接觸，以免特種溶解消失；觀察揮發(fā)油、樹(shù)脂等，則不可與高濃度乙醇或其它有機(jī)溶劑接觸。切片徒手切片在檢驗(yàn)工作中，此法最常用，操作簡(jiǎn)便，迅速，制成的切片可保持其細(xì)胞內(nèi)含物的

7、固有形態(tài)，便于進(jìn)行各種顯微化學(xué)反應(yīng)觀察。切片：右手持刀片，左手拇指和食指夾持樣品，中指托著樣品的底部，使樣品略高出食、拇二指，肘關(guān)節(jié)應(yīng)固定，使樣品的切面保持水平，刀口向內(nèi)并使刀刃自前右切削，即可切得薄片。操作時(shí)，樣品的切面和刀刃須經(jīng)常加水或稀乙醇保持濕潤(rùn)，防止切片粘在刀片上。切好的切片用毛筆蘸水輕輕從刀片上推入盛有水或稀乙醇的培養(yǎng)皿中?；咔衅瑱C(jī)切片此法不需要較高的技切，只要了解掌握操作方法，短時(shí)間內(nèi)即可學(xué)會(huì)并切出較薄的切片，適用于質(zhì)地堅(jiān)實(shí)、形狀較大的藥材樣品，柔軟的樣品經(jīng)冷凍處理亦可切得較薄的切片。切片機(jī)調(diào)試及材料安裝：切片前，先安置好切片機(jī)使穩(wěn)固，進(jìn)行調(diào)試檢查。將切片刀夾持在夾刀器上夾緊，

8、調(diào)整刀的角度（約015）；調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器至所需厚度。把制備好的樣品用兩塊軟木夾住或直接放在切片機(jī)的材料固定架上夾緊夾正，使樣品露出軟木塊或固定器上端約0.5cm,調(diào)整好樣品高度，使刀刃靠近樣品的切面，使樣品切面與刀刃平行并略高于刀刃約0.51mm。切片：用右手握夾刀器柄。往操作者方向迅速拉動(dòng)，便切下切片，且附著于刀的表面上，用毛筆蘸水把切片放于盛水的培養(yǎng)皿中。將刀推回原處，轉(zhuǎn)動(dòng)厚度推進(jìn)器，用毛筆直蘸水潤(rùn)濕樣品切面及刀刃，再拉切片刀，往返推拉，可得到許多厚度均勻、完整的切片。若切片不成功，應(yīng)檢查切片刀是否鋒銳，否則應(yīng)磨刀或換鋒銳的切片刀，若切得太薄而破碎，則逐漸增加厚度至能切得完整的薄片為度。注

9、意：夾持在材料固定器上的樣品切面接近于固定器上端時(shí)，必須注意防止切片刀刃碰撞固定器而損毀切片刀。裝片選取薄而平整的切片置載玻片上，根據(jù)所要觀察的內(nèi)容要求，滴加適宜的試液12滴，蓋好蓋玻片，即可在顯微鏡下觀察。為防止切片彎卷，可選取理想的切片，用兩張載玻片夾往，放置水中放置4小時(shí)左右將切片壓平，取出，置乙醇中固定，再以稀甘油裝片觀察。如需透化，可在載玻片上放有切片處，滴加12滴水合氯醛試液，在酒精燈上微微加熱，至邊緣起小泡即停止加熱，繼續(xù)補(bǔ)充試液再加熱，直至切片透化完全為止；加熱溫度不能過(guò)高，以防水合氯醛試液沸騰，使組織內(nèi)帶入氣泡；加熱時(shí)應(yīng)將載玻片不斷移動(dòng)，不宜對(duì)準(zhǔn)一處燒，以免受熱不勻而炸裂；透

10、化后放冷，加甘油乙醇試液12滴后蓋上蓋玻片，貼上標(biāo)簽。冬日室溫較低時(shí)，透化后可不待放冷即滴加甘油乙醇試液，以防水合氯醛結(jié)晶析出而防礙觀察。粉末制片主要用于粉末狀的藥材和飲片及含飲片粉末的制劑的觀察。粉末制備藥材要先干燥，磨或銼成細(xì)粉（過(guò)四號(hào)篩），裝瓶，貼上標(biāo)簽。粉末制備時(shí)，注意取樣的代表性，例如：根類藥材要切取根頭、根中段及根尾等部位，必須全部磨成粉，不得丟棄渣頭。并需通過(guò)4號(hào)篩，混合均勻。干燥時(shí)，一般溫度不能超過(guò)60，以免淀粉粒糊化，難以觀察其完整者。粉末制片法用解剖針挑取粉末少許，置載玻片的中央的位置，加適宜的試液1滴，用針攪勻（如為酸或咸時(shí)應(yīng)用細(xì)玻棒代替針），待液體滲入粉末后，用左手食指

11、與拇指夾持蓋玻片的邊緣，使其左側(cè)與藥液層左側(cè)接觸，再用右手持小鑷子或解剖針托住蓋玻片的右側(cè)，輕輕下放，則液體逐漸蔓延充滿蓋玻片下方。如液體未充滿蓋玻片，應(yīng)從空隙相對(duì)邊緣滴加液體，以防產(chǎn)生氣泡；若液體過(guò)多，用濾紙片吸去溢出的液體，最后在載玻片的左端貼上檢品的標(biāo)簽或?qū)懮蠘?biāo)記。成方制劑粉末制片按劑型不同，分別將樣品處理后，按粉末制片法裝片觀察散劑、膠囊劑，可直接取適量粉末（內(nèi)容物為顆粒狀，應(yīng)研細(xì)）裝片或透化后裝片。片劑，可取23片；水丸、糊丸、水蜜丸、錠劑等（包衣這除去包衣）取數(shù)丸或12錠，分別置乳缽中研細(xì)，取粉末適量裝片或透化裝片。蜜丸樣品可用兩種方法處理。用解剖刀沿蜜丸正中切開(kāi)，從切面由外至中央

12、挑取適量樣品，置載玻片中央，滴加適宜的試液，用玻璃棒攪勻。按上述粉末制片法制片，或透化裝片。將蜜丸切碎放入容器中，加水適量，攪拌；亦可用超聲儀處理，使其分散，然后置離心管中離心沉淀，如此反復(fù)以除盡蜂蜜，取沉淀物適量裝片或透化后裝片。含揮發(fā)性成分的制劑，取其粉末進(jìn)行微量升華裝片。粉末制片的注意事項(xiàng)藥材和飲片粉末制片時(shí)，每片取用量宜少不宜多，為使觀察全面可多做些制片。如取樣多，顯微特征重疊輪廓不清，反而費(fèi)時(shí)，不易得出準(zhǔn)確的結(jié)論。成方制劑粉末檢查，是在多味飲片粉末中尋找某一藥味的某一顯微特征，有時(shí)較難查見(jiàn)，可以去粉末適量，置試管或小燒杯中，加水合氯醛試液透化（加適量甘油以防水合氯醛結(jié)晶析出），攪勻，

13、用吸管吸取混懸液裝片，觀察。如粉末樣品如用水或甘油裝片時(shí)，可先加少量乙醇使其潤(rùn)濕，可避免或減少氣泡的形成，或反復(fù)將蓋玻片沿一側(cè)輕抬，亦可使多數(shù)氣泡逸出。攪拌時(shí)產(chǎn)生的氣泡可隨時(shí)用針將其移出。裝片用的液體如易揮發(fā)，應(yīng)裝片后立即觀察。用水裝片也較易蒸發(fā)而干涸，通常滴加少許甘油可延長(zhǎng)保存時(shí)間。表面制片主要用于葉類、花類（萼片、花瓣）、果實(shí)、草質(zhì)莖及鱗莖等藥材或飲片的表面特征如毛茸、氣孔、表皮細(xì)胞等的觀察。質(zhì)地菲薄的藥材或飲片可以整體裝片；較厚的藥材或飲片則須撕下表皮然后裝片。整體裝片適用于較薄的葉片、萼片和花瓣、剪取欲觀察部位約4mm2的兩小片，一反一正放在載玻片上，加水合氯醛試液，加熱透化至透明為止

14、，再滴加封藏液，蓋好蓋玻片，即得。表面撕離裝片凡較厚的或新鮮樣品不便于整體裝片，多采用表面撕離裝片。將軟化或新鮮樣品固定住，然后用鑷子夾住要?jiǎng)內(nèi)∷弘x的部分，小心的撕離，或用解剖刀輕輕割（刮）去不需要的各層組織，只保留表皮層（上層或下層），將欲觀察的表破表面觀朝上，置載玻片上，加水合氯醛試液加熱透化后，再滴加封藏液，蓋上玻片，即得。解離組織片適用于厚壁組織或輸導(dǎo)組織等的單個(gè)細(xì)胞的顯微觀察。將樣品切成段（長(zhǎng)約5mm，直徑約2mm）或片（厚約1mm），觀察纖維或?qū)Ч艿茸詈们谐煽v長(zhǎng)的小段。根據(jù)細(xì)胞壁的性質(zhì)，按照下列方法之一進(jìn)行處理：如對(duì)于薄壁組織占大部分，木化組織少或分散存在的樣品，采用氫氧化鉀法；若

15、樣品堅(jiān)硬，木化組織較多或集成較大群束，采用硝鉻酸法或氯酸鉀法。4.4.1氫氧化鉀法置樣品于試管中，加5%氫氧化鉀溶液適量，加熱至用玻璃棒擠壓，能離散為止，傾去堿液，加水洗滌后，取出少量置載玻片上，用解剖針?biāo)洪_(kāi)，滴加稀甘油蓋上蓋玻片。硝鉻酸法置樣品于試管中，加硝鉻酸試液適量，使之浸沒(méi)樣品，放置約3060分鐘，堅(jiān)硬的樣品需時(shí)要長(zhǎng)些，也可在水浴上微溫，至用玻璃棒擠壓能離散為止，傾去酸液，用水洗滌后，照氫氧化鉀法裝片。氯酸鉀法置樣品于試管中，加硝酸溶液（12ml）及氯酸鉀少量，緩緩加熱，待產(chǎn)生的氣泡漸少時(shí)，再及時(shí)加入氯酸鉀少量以維持氣泡穩(wěn)定地發(fā)生，至用玻璃棒擠壓能離散為止。傾去酸液，用水洗滌后，照氫氧

16、化鉀法裝片。注意事項(xiàng)用氯酸鉀法制片時(shí)，每次加入的氯酸鉀不可過(guò)多，加熱溫度不宜過(guò)高，否則突沸容易使液體逸出管外。加熱時(shí)間長(zhǎng)短因樣品的硬度和木化程度而異，通常約需515分鐘。操作過(guò)程中產(chǎn)生的氯氣有毒，應(yīng)注意通風(fēng)。用硝鉻酸法解離也可在載玻片上進(jìn)行。即取一塊厚度適當(dāng)?shù)那衅?，置載玻片上，滴加硝鉻酸試液使之浸沒(méi)，放置約20分鐘后，輕輕壓下或移動(dòng)蓋玻片使之分離其余操作同時(shí)，法解離的細(xì)胞，可以看清其分離的組織部位?；ǚ哿Ｅc孢子制片取花粉、花藥（或小的花）或孢子囊群（干燥樣品浸于冰醋酸中軟化），用玻璃棒搗碎，紗布過(guò)濾，濾液置離心管中，離心，取沉淀加新鮮配制的醋酐與硫酸（9：1）的混合液13ml,置水浴上加熱23

17、分鐘，離心，取沉淀，用水洗滌2次，取沉淀物少量，置載玻片上，直接用水合氯醛試液裝片，具體操作同粉末標(biāo)本片?；蚣?0%的甘油與1%苯酚各12滴，用品紅甘油膠封藏觀察。磨片法制片凡需觀察斷面，以一般切片無(wú)法制作的標(biāo)本，如堅(jiān)硬的動(dòng)物、礦物為藥材你或飲片，如珍珠、石決明、動(dòng)物骨骼、礦石等可采用磨片法制片。片的厚度一般為2050口m。磨片方法有手工磨制與機(jī)器磨制。手工磨制選取合適的材料，一般以12mm為度，先置粗磨石（或磨砂玻璃板）上，加適量水，用食指、中指夾材料，在磨石上往返磨礪，待兩面磨平，厚度約數(shù)百口m時(shí)，移至細(xì)磨石上，加水，用軟木塞壓在上面，往返磨礪至透明，用水沖洗，再用乙醇處理和甘油乙醇試液裝

18、片。機(jī)器磨制地質(zhì)礦產(chǎn)部門有專門人員與設(shè)備制作。顯微測(cè)量顯微鑒定時(shí)應(yīng)用于測(cè)量細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)含物等大小的方法，應(yīng)用最多的則是長(zhǎng)度測(cè)定。常用的量具是目鏡測(cè)微尺與載物臺(tái)測(cè)微尺。目鏡測(cè)微尺又稱目鏡量尺或目微尺。它是放在目鏡筒內(nèi)的一種標(biāo)尺，是一個(gè)直徑1820mm的圓形玻璃片，中央刻有精確等距離的平行線刻度，常為50或者100格。目鏡測(cè)微尺是用以直接測(cè)量物體的，但其刻度所代表的長(zhǎng)度是根據(jù)顯微鏡放大倍數(shù)不同而改變，故使用前必須用載物臺(tái)測(cè)微尺來(lái)標(biāo)定。載物臺(tái)測(cè)微尺又稱鏡臺(tái)測(cè)微尺或臺(tái)微尺。它是一種特制的載玻片，中央粘有一刻有精細(xì)尺度的圓形玻片，通常將長(zhǎng)1mm（或2mm）精確等分為100（或200）小格的細(xì)線，每一小格

19、長(zhǎng)為10口m,它是用以標(biāo)定目鏡測(cè)微尺的。目鏡測(cè)微尺的標(biāo)定，以確定使用同一顯微鏡及特定倍數(shù)的物鏡、目鏡和鏡筒長(zhǎng)度時(shí)，目鏡測(cè)微尺上每一格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度。標(biāo)定方法：將載物臺(tái)測(cè)微尺置于顯微鏡鏡臺(tái)上，按常規(guī)對(duì)光調(diào)焦，并移動(dòng)測(cè)微尺物象于視野中央；從鏡筒中取下目鏡，旋下接目鏡的目鏡蓋，將目鏡測(cè)微尺放入目鏡筒中部的光欄上（應(yīng)正面向上），旋上目鏡蓋后返置鏡筒上。此時(shí)在視野中，除載物臺(tái)測(cè)微尺的物象外，還同時(shí)可觀察到目鏡測(cè)微尺的分度小格，移動(dòng)載物臺(tái)測(cè)微尺和旋轉(zhuǎn)目鏡，使兩種量尺的刻度平行。左邊的“0”刻度重合，尋找第二條重合刻度。記錄兩刻度的讀數(shù)，并根據(jù)比值計(jì)算出目鏡測(cè)微尺每小格在該物鏡條件下所相當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度（口m）。測(cè)定細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)含物的方法將預(yù)測(cè)目的物的顯微制片置載物臺(tái)上，對(duì)光，調(diào)焦，移動(dòng)載片，使需測(cè)量的目的物置于目鏡量尺范圍內(nèi)，調(diào)清物象，計(jì)數(shù)出目的物占測(cè)微尺的小格數(shù)，乘以目鏡尺每1小格的長(zhǎng)度值即得。計(jì)算公式：待測(cè)物體長(zhǎng)度（口m）=鏡臺(tái)微尺與目鏡微尺重合時(shí)所具的長(zhǎng)度義所測(cè)物體占有目鏡測(cè)微尺的格數(shù)目鏡測(cè)微尺