BDFACSCalibur流式細胞術(shù)標準操作規(guī)程

1、BD FACSCalibur流式細胞儀操作與維護程序目的：規(guī)范BDFACSCalibur流式細胞儀操作與維護程序，正確使用設備，保證實驗順利進行、操作人員人 身安全和設備安全。適用范圍：本規(guī)程適用于BD FACSCalibur流式細胞儀的使用操作。責任者：操作人員：負責按照本規(guī)程操作儀器設備，對儀器進行日常維護，并作使用記錄。保管人員：負責監(jiān)管儀器操作是否符合規(guī)程，并對儀器進行定期維護、保養(yǎng)?？剖邑撠熑耍贺撠煂x器設備的綜合管理。內(nèi)容：每日開機程序在氣壓閥減壓的狀態(tài)下檢查鞘液桶，確認：鞘液充滿狀態(tài)，約3L蓋緊蓋子安上金屬擋板管路暢通，無扭曲.檢查廢液桶，確認：廢液桶充滿400ml漂白劑管路暢通

2、，無扭曲打開流式細胞儀。打開電腦。氣壓閥置于加壓位置，并排除管路中氣泡。做 Prime。等待機器預熱510分鐘后可開始試驗。每日關機程序用3mlFACSCIean洗液加入樣品管中上樣，將樣品支撐架置于旁位，以外套管吸入1ml。將樣品支撐架置于中位，以HI RUN運行10分鐘，使內(nèi)管吸入約1ml。將樣品管換成蒸餾水重復1-2步。放置盛有1ml蒸餾水的試管于樣品支撐架上。選擇Standby模式10分鐘，將激光冷卻后可關掉主機。退出所有應用軟件，關閉電腦。將流式細胞儀的壓力閥置于減壓狀態(tài)。每月維護程序?qū)ACSClean洗液12L裝入鞘液桶。旁路鞘液過濾器（過濾器上的快速接口從SANLINEFILT

3、ER端斷開，將鞘液白色管路液路取下聯(lián)到SANLINE FILTER 端口），以防傷害。將盛有3ml FACSClean洗液的試管置于樣品支架上，以HI RUN 30分鐘。將鞘液和樣品換成蒸餾水重復步驟3,以HI RUN 60分鐘。將鞘液桶裝滿鞘液，恢復過濾器。以 HI RUN 10-20 分鐘。在測定正式樣品之前實施每日開機程序。FACScomp自動質(zhì)控操作試劑準備三色試劑的校正（Cat No ： 340486）取四色試劑盒中的Unlabeled試劑，充分混勻，加一滴到裝有1ml鞘液的試管中，混勻，標記為unlabeled 。取FITC、PE、PerCP、unlabeled試劑，充分混勻，各加

4、一滴到第二支裝有2ml的鞘液的試管中，混 勻，標記為mixed 。上機進行儀器的校準?；蛩纳噭┑男Ｕ–at No： 340486； Cat No:340487）取試劑盒中的unlabeled試劑和APC試劑各一滴加入到第一支裝有1ml鞘液的試管中，混勻。取5種試劑（FITC、PE PerCP、APC Un labeled）各一滴加入第二支裝有2ml鞘液的試管中，混勻。上級進行儀器的校準。Calibrite beads FACScomp上機操作的具體步驟執(zhí)行FACSalibur開機程序；執(zhí)行 FACScom歌件；在運行“ Sign in ”窗口中輸入操作者姓名、單位、領導姓名等相關信息，計算

5、機將保存這些信息；單 機“ Acceppt ”；進入Set Up窗口，先看最左側(cè)的Assay selection選項，在里面選中Lyse/Wash或Lyse/NoWash；在Calibrite Beads Lot IDS中，根據(jù)每種顏色的beads所對應的Lot ids，輸入編號，次編號在 Calibrite Beads試劑盒內(nèi)，打開新買的試劑盒，里面有一張橙色膠紙，取出貼在試劑盒的背 面，標題是Calibrite BeadsT%Batch NO，選擇FACS Flow Sheath下的編號（右側(cè)的編號）；如做四色校正，同樣方法輸入 Calibrite Beads tm APC的IDS。在右側(cè)

6、的保存選項中文件會自動保存，路徑FacstationBD fileFACSCompDDMMYY還可以單擊“ Location ”改變保存路徑；其他的不要改動，直接單擊“ run”出現(xiàn) PMT視窗，然后準備好上樣管；上第一管后單擊start，儀器開始自動調(diào)節(jié)PMT完成后儀器會在窗口底部出現(xiàn)一行提示：“ PMTs set Successfully ，這時軟件會暫停5秒，然后自動進入下一個調(diào)節(jié)窗口 （Comp窗口）；如果是四色微球調(diào)試，儀器還會對激光的延遲進行測試，直到儀器電腦屏幕出現(xiàn)提示：“Time DelayCalibratio n was successful，然后才會同樣自動進入下一個調(diào)節(jié)窗

7、口（Comp窗口）；上第二管，單擊start，儀器開始自動調(diào)節(jié)補償并進行靈敏度測試。完成后儀器會給出提示，最后軟件給出一個Summary Report。檢查報告中的“ Result ”是否都PASS如果有沒有PASS堅 持原因。（1）是否試劑過期（2）兩個試管中的液體和鞘液桶中的是否相同（3）鞘液是否合格（4）日常維護是否充分適當（5）聯(lián)系BD人員打印報告，退出FACScom軟件；計算機會自動把FACScom測試結(jié)果保存在Calib File或Calib File .LNW （免洗試驗）中，運行其他程 序，調(diào)用這些結(jié)果就可以進行樣本的檢測。注意事項：1、第一管的速率不能低于400個/秒（run

8、 high），少于時可以補一滴Unlabeled。2、兩個試管中的鞘液必須和鞘液桶中的是同一種液體。FACScomp校正HLA-B27的操作說明試劑的準備：取HLA-B27試劑盒的HLA-B27 calibration beads （Cat No : 340183）試劑，混勻，加兩滴到裝有1ml鞘液 的試管中，混勻，待測。FACScomp上機檢測HLA-B27的具體步驟執(zhí)行FACSCalibur開機程序；運行 FACScomp 軟件；在出現(xiàn)“ Sign in ”窗口中輸入操作者姓名、單位、領導姓名等相關信息，計算機將保存這些信息；單 機“ Accept ”；進入“ Set up ”窗口，先看最

9、左側(cè)的 Assay selection 選項，選擇 HLA-B27 Assay，在進行 HLA-B27 Assay之前，必須一次性的通過Lyse/Wash Assay校正；在右側(cè)框中輸入正確的HLA-B27 Lot No值、Suffix值和Beads Lot No值。這些參數(shù)分別決定了 FL1 PMT的標準和decision maker的位置。對于結(jié)果至關重要，不可弄錯；在右側(cè)的保存選項中文件會自動保存，路徑日期，還可以單擊“ Location ”改變文件保存路徑；其他的不需要改動，直接單擊“run ”出現(xiàn)PMT視窗，然后準備好上樣；放上Beads管后單擊start，儀器開始自動調(diào)節(jié)PMT完成

10、后儀器會在底部出現(xiàn)一行提示：“PMTs set successfully ”這時軟件會暫停5秒，調(diào)試后的結(jié)果會自動保存在Calib File.B27中，并生成summary Report；退出FACScomp軟件，然后進入HLA-B27軟件進行檢測。MultiSET四色免洗淋巴細胞亞群的絕對計數(shù)實驗原理：用已知總數(shù)的熒光微球Beads做標準內(nèi)參，加入血中，再加入熒光抗體，應用流式細胞儀中的獲取和分析軟件，就可以得出血中CD3 CD4 CD8 B、NK細胞的絕對數(shù)。細胞（/ ul）=（細胞獲取數(shù)x Beads總量）/（ Beads獲取數(shù)樣本量）主要試劑：抗體：CD3/CD8/CD45/CD4 C

11、D3/CD16+56/CD45/CD19 四色熒光抗體。Trucount管（內(nèi)含數(shù)量已知的Beads）。FACS Lysing Solution （溶血素）（1 0 x，使用前用蒸餾水稀釋成1x）實驗步驟 :取2支TruCount管，順序編號A和B;用反向加樣法在Tube中加入50ul充分混勻的抗凝全血；注意：血不要碰到試管底部的微球 （Beads）。取 20ulCD3/CD8/CD45/CD4 抗體加入到 A 管中；取 20ulCD3/CD16+56/CD45/CD19 抗體加入到 B 管中。注 意：不要碰到血。渦旋混勻，室溫避光放置15-20min ；634加入450譏1 X FACS溶血

12、素，充分混勻，室溫避光放置15min ;24小時內(nèi)上機，用MultiSET軟件獲取15000個細胞進行檢測，上機前應充分混勻。注意事項：樣本使用EDTA抗凝全血，室溫放置，24小時內(nèi)處理，處理前充分混勻。取血時要采用反向加樣法，即加樣槍吸取血樣時，打到第二擋，放時打到第一檔，保證血量的準確，減少 誤差。染色和溶血步驟應在室溫避光進行，并充分混勻，過程中盡量防止血樣的飛濺，以免血樣留在管壁上。本實驗為免洗試劑，操作簡單，減少細胞的丟失提高工作效率和計數(shù)精確度。TruCOUNT管2-25C保存，從冰箱取出后，應恢復室溫再打開封條，保證TruCOUNTf包裝袋密閉，袋內(nèi)干燥劑變成粉紅色時，TruCO

13、U NT管應棄去不要MultiSET軟件收獲分析的具體操作執(zhí)行FACSCalibur開機程序，進入MuliTSET軟件。在出現(xiàn)“sign in ”窗口中輸入操作者姓名、單位、負責人姓名等信息，計算機將保存這些信息；相關信息，單機 Accept ”。進入“ set up ”窗口：在“ Data Source ”對話框中選擇“ From Cytometer : Acquisition and Analysis ”；在“ Automatic Saving Options ”中選者 Data File ”,laboratory Report 、“PhysicianReport ”，軟甲會自動生成并保存

14、報告文件，文件的默認路徑FaacstationBD fileMultisetDDYYMM文件夾； 7.4 在“ View Report ”中選擇“ Until Next Button Pressed ” .然后單擊“ Accept ”，進入“ FACSComp窗口，單擊“ skip FACSComp （四色儀器調(diào)整FACSComp在檢測前單 獨完成，見FACSCom操作部分）。進入“ Test Prefs ”窗口，在“ Physicians Report Choices ” 一項可以全選，運行一種試劑，會自動報 告相應的結(jié)果。在“ Lot ID ”中輸入TruCount管批號和Beads總數(shù)（

15、標在包裝袋上），單擊“ Accept ”。進入“ Samples”窗口，在表格中輸入相應的Patient Name、IDCase Number和在Panel中選擇 4color TBNK+Truc ；在窗口最上方“ Cytometer ”的下拉菜單中依次選擇“ Detectors/Amps 、“ Threshold ”, “Compensation ”“Staus ，出現(xiàn)相應的四個窗口；在“Cytometer的下拉菜單中，單擊“InstrumentSetting ”，在出現(xiàn)的新對話框中單擊“open ”；打開路徑下 FacstationBD fileInstrumentSettingCalib

16、ur.LNW文件，調(diào)用儀器各個參數(shù)條件，最后單擊“Open”“Set”“Done”。單擊“ Run Test ，上樣，此時調(diào)整SSC電壓和閾值，單擊“ Acquire ”。獲取完成后，可以打開屏幕底部的“Manual Gate”人工調(diào)整各個門的大小，單擊“Continue ”，進入醫(yī)生報告窗口“ Phys Report ”，可打印。繼續(xù)其他實驗，或單擊“ Quit ” , “Don,t Save ” ,退出MultiTest軟件。操作中特別注意第3-7步， 尤其是第7步。注意：做相對計數(shù)時，用普通的流式管代替TruCount管，在Panel中選擇4colorTBNK。做三色絕對或相對計 數(shù)時，

17、只需改變Panel即可。CellQuest Pro雙色淋巴細胞亞群分析樣本制備實驗目的:使用雙色組合標記抗體對人外周血中淋巴細胞亞群進行檢測，了解認得免疫狀態(tài)。從而指導臨床 診斷和治療。實驗原理:利用熒光技術(shù)，在不同的鼠抗人的抗體上標記熒光素，此熒光抗體就同人淋巴細胞表面是CD分子 特異性的結(jié)合；然后用流式細胞儀檢測，結(jié)合分析軟件的自動分析，便可以得出各亞 群細胞的百分比。主要試劑：流式細胞儀（FACSCalibur）,臺式離心機，渦旋振蕩器，微量移液器（1000 P L, 200 P L, 20P L,流失細胞專業(yè)試管、鞘液；PBS (加0.1%疊氮鈉)；832 雙色檢測試劑： Isotyp

18、e Control ( MouselgG/IgG 2a)(CD3-FITC/CD19-PE CD3-FITC/CD4-PE CD3FITC/CD8-PE CD3-FITC/CD16+CD56-PEFACS Lysi ng Solution紅細胞裂解液(10 x，使用前用蒸餾水稀釋成1 x)o1%的多聚甲醛，配制方法：稱1.0克多聚甲醛加少量PBS放入56C水浴箱中使之溶解，用1N NaOH溶液和1N的HCL調(diào)整PH值在6.9-7.0,然后加入100ml容量瓶中定容，最后用0.45 P m的濾膜過濾。實驗步驟：取5支流式試管，編號為1、2、3、4、5,分別取10 P L抗凝全血加入每支試管中，注

19、意不 要碰到管壁。輕輕混勻，依次加入 20 P L 雙標 Isotype Control ( MouselgG/IgG 2J、CD3/CD19 CD3/CD4 aCD3/CD8 CD3/CD16+CD5熒光抗體。室溫避光保存20分鐘。取出試管，每管加入10倍稀釋的1 x FACS Lysing Solution 2ml，渦旋混勻，避光10分鐘。300g離心5min,棄去上清液。每管加入2ml的PBS渦旋混勻，300g離心5min,棄去上清液。然后加入0.5mlPBS混勻，4 C避光1h內(nèi)上機檢 測；若不能及時上機，加入0.5ml 1%多聚甲醛，放4c冰箱保存，48h內(nèi)上檢測。CELLQuest

20、 Pro的簡要操作步驟(1)Acquisition獲取數(shù)據(jù)打開獲取模板(ACQ文件)，如無現(xiàn)成的模板則制作新模板：選擇點圖或直方圖工具,在窗口拖出大小合適的方框,點擊圖形的邊緣Windows-show Inspector , Inspector 窗口選擇：Plot Type 點圖類型：如 Acquisition 獲取X Parameter 橫軸參數(shù)：如 FSC;Y Parameter 縱軸參數(shù)：如 SSCGate 設門：如 No Gate 或 G1=R1圖形設置完畢，選擇SAVE AS/保存為 ACQ文件聯(lián)機 Acquire Connect to cytometer，出現(xiàn) Acquisitio

21、n control 禾口 Browser 窗口，先將 Browser 窗口最小化；數(shù)據(jù)獲取前的設定：Acquire Acquisition & Storage-設定獲取細胞數(shù)(10000-ALL)-OK打開最小化的-Browser對話框選擇：Directory :單機Change設定存儲數(shù)據(jù)文件的文件夾；File設定數(shù)據(jù)文件的名字：文件前綴(Prefix )-自定義；文件后綴(Suefix )-管號(設為1),單機ok；檢測或設置panel ,確定試驗組合；如果沒有相應的panel則設置新的panel ： Acquire Edit panel ,在彈出的對話框單擊add選 項，在new pan

22、el中輸入新的panel名稱,然后單擊前面的三角選中該panel激活Tubes窗口，單擊add加試驗管，編輯各 試驗管的P1, P2, P3, P4確定實驗組合，單擊ok；然后按照已有panel操作；已有 panel 的在 Un titled Acquire Tube List下來菜單中選擇 Load Tubes From Pan el 4選擇新編輯或?qū)嶒瀸?panelAcquire Counter 打開計算器。打開獲取條件窗口，調(diào)出實驗獲取條件(Instrument Setting )Cytometer-Detectors/Voltage , Threshold , Compensati

23、onCytometer-Instrument Setting-Open 打開實驗獲取條件(FACSStation-BD File- Instrument SettingFiles-Calib file 或者 Calib file.LNW) Open-set-done943實驗獲取條件的調(diào)整：Acquisition Control-VSetup-上樣(第一管)-Acquire-進行實驗獲取條件的調(diào)整：FSC SSC電壓。FSC閾值(Threshold)：減少碎片。設門：FSC/SSC點圖設門（R1）；熒光（FL）點圖（如FL1/FL2 ）或直方圖（如FL1）取門G仁R1 （點 擊圖形 的邊緣-I

24、nspector-Gate ： G1=R1）。陰性對照管，調(diào)整熒光電壓（FL1、FL2、FL3、FL4Voltage），使陰性群體在左下角，確定十字位 置。換地2管，多色實驗的補償管（單陽性），調(diào)整熒光間補償（Compensation）：（1 ） Cytometer-Instrument Setting-Save 保存實驗獲取條件（InstrSet+ 實驗獲取名稱）-Done （此步驟為可選項）；尸n0-5丫0保存模板ACQ文件（新作模板）。（2） Acquisition-Counter，打開計數(shù)器。9.5順序上樣，獲取數(shù)據(jù)文件：Acquisition Control- Setup-上樣-Ac

25、quire-儀器獲取足夠細胞后， 自動保存數(shù)據(jù)文件（data file），Quit- Don,t saveCELLQuest Pro的簡要操作步驟（2）A nalysis數(shù)據(jù)分析（新作模板人附文件）做FSC/SSC點圖，圈細胞R1選擇點圖工具，在窗口拖出大小合適的方框，點擊圖形邊緣Windows-show Inspector , Inspector 窗口選擇：Analysis 分析；Select File 選擇第一管數(shù)據(jù)文 件；X Parameter 橫軸參數(shù) -FSC;Y Parameter 縱軸參數(shù) -SSC; Gate 設門 -No Gate 10.1.1.3選擇設門工具-在FSC-SS

26、C點圖上，圈細胞R1做陰性對照管門內(nèi)細胞的FL1/FL2點圖，設十字，區(qū)分陰性和陽性界限選擇點圖，在窗口拖出大小合適的方框，點擊圖形邊緣Windows-show Inspector , Inspector 窗口選擇：Analysis 分析；Select File 選擇陰性對照管數(shù)據(jù) 文件；X Parameter 橫軸參數(shù) -FL1;Y Parameter 縱軸參數(shù) -FL2; Gate 設門 -G1=R1 10.1.2.3選擇十字工具-在陰性對照管FL1/FL2點圖上，沿陰性群體設十字 10.1.3做各實驗管門內(nèi)細胞的FL1/FL2點圖，拷貝陰性對照管的十字.1選擇點圖，在窗口拖出大小合適的方

27、框，點擊圖形邊緣.2 Windows-show Inspector , Inspector 窗口選擇：Analysis 分析；Select File 選擇實驗管數(shù)據(jù)文 件；X Parameter 橫軸參數(shù) -FL1;Y Parameter 縱軸參數(shù) -FL2 ； Gate 設門 -G1=R1 10.1.3.3店中陰性對照管FL1/FL2點圖上的十字二Edit-Copy-點中試驗管FL1/FL2點圖-Edit-Paste 10.1.4做各實驗管FL1/FL2點圖的十字統(tǒng)計：點中試實驗管FL1/FL2點圖-Stat-Quadrant Stat- 出現(xiàn)統(tǒng)計結(jié)果-點中統(tǒng)計結(jié)果框-Stat-Edit Q

28、uadrant Stat-選擇輸出結(jié)果（如Percent of gated門內(nèi)細胞陽性百 分率）。選擇文字工具（A）,在報告上添加文字說明，報告實驗結(jié)果。Save As保存分析模板（ANA文件）或分析結(jié)果，Print打印分析結(jié)果。An alysis數(shù)據(jù)分析（已有模板ANA文件）打開已保存的分析模板（ANA文件），依次改變各圖要分析的數(shù)據(jù)文件（Edit-Select All-Plots-Change Data File ），在出現(xiàn)的窗口中按文件存儲路徑找到數(shù)據(jù)，選中第一關文件-open ；在空白處單擊一下鼠標，選中第 三個圖標按蘋果+調(diào)出第二管文件；第四個圖蘋果+ 以此類推，調(diào)整圈細胞群的門R1

29、的位置，調(diào)整十字門位置，根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果更改報告中結(jié)果，打印分 析結(jié)果。HLA-B27分析和軟件操作1.1 試劑：HLA-B27試劑盒-包括抗體試劑A,10 X溶血素試劑B,微球試劑C抗凝全血流式細胞實驗常規(guī)試劑和儀器。11.1.2制備流程：在試管上對應于每一個樣本做好識別標志（每個樣本一個試管）加30 L抗體到試管中11.1.2.3用微量移液器小心滴將50 11.1.2.3用微量移液器小心滴將50 PI充分混勻的康寧血加到進樣管的底部，確保WBC勺濃度在3.533X 10 -9.4 X 10 WBC L之間，低速混勻3秒鐘，室溫避光靜置15-20分鐘；注意：小心避免血樣加到試管壁上，一面血與試劑

30、不能充分接觸，靜置時避免樣本直接光照。S10X溶血素用蒸餾水稀釋成1X,每管中加入2ml試問的1 X溶血素，立即低速混勻，避光試問靜置10分鐘，不要超過12分鐘；注意：溶血時間不應太長，以免破壞白細胞。隨后室溫300g離心5min棄去上清液，留大約50 PL液體于試管中以免損傷細胞團低速混勻，重懸細胞，每管中加入2ml含0.1%疊氮鈉的PBS清洗細胞，低速混勻，室溫300g 離心 5min吸去上清液，留大約50 PL液體于試管中以免損傷細胞團低速混勻，重懸細胞，每管中加入含1%-2%多聚甲醛的PBS來固定細胞，低速混勻，固定30分鐘將已處理好的樣本管蓋好，避光保存于2-8C以待上機檢測。最好在

31、染色后24小時以內(nèi)分析樣本，上樣前充分混勻懸液以防細胞聚集。HLA-B27自動軟件上機檢測的具體步驟執(zhí)行FACSCalibur開機程序，進入HLA-B27軟件。在出現(xiàn)的“sign in ”窗口中輸入操作者姓名、單位、領導姓名等相關信息，單擊“ Accept ”，計 算機將保存這些信息。進入$0士 up”窗口，首先在Data Source ”對話框中選擇“From Cytometer ，并輸入15000”。然后 在：“File name perfix ”中選擇“ Patientname ”；在“Automatic Saving Options”中選擇好Data File ”、“ Laborato

32、ry Report ”，軟件會自動生成一個文件夾，文件的默認路徑Facstation G5BD filesHLA-B27DDMMYY文件夾；C）單擊“ Location ”可改變文件保存路徑；在出現(xiàn)的新的對話框中指定的文件夾，選好文件夾后，單擊對話 框底部的“ chose ”（此步驟為可選項）。D）在“ View Report ” 中選擇“ Un til Next Button Pressed ；最后單擊“ Accept ”。進入“ FACSCon”窗口，在這里可以進入FACSCom軟件，做HLA-B27 beads的調(diào)試。如果之前做了就單擊“ Skip FACSComp”。進入“ Patie

33、nts ”窗口，在表格中輸入相應的 Patient Name、ID、Case Number。然后單擊“ Rur”，單擊“ Acquire 。不要調(diào)節(jié)儀器的設置，儀器會自動調(diào)出條件。獲取完成后打印Laboratory Report 。如果要繼續(xù)檢測單擊“ More Tests ”，如果退出單擊“ QUIT” - Don t save ”。退出軟件，按每日關機程序清洗儀器，關機。或用Cellquest Pro/Cellquest手動軟件進行HLA-B27獲取和分析打開獲取模板（HLA-B27 ACQ文件）；或制作新模板：選擇點圖或直方圖工具，總共畫三個圖，兩個散點圖，一個直方圖。散點圖 FSC/S

34、SC 畫出一個新的散點圖后，在Windows-show Inspector , Inspector 窗口選擇：Acquisition-Analysis 分析；X Parameter 橫軸參數(shù)：FSC; Y Parameter 縱軸參數(shù)：SSC; 選擇 Multicolor gate 屬性，Gate 設門：如 No Gate ；散點圖 FSC/CD3PE,畫出一個新的散點圖后，在 Windows-show Inspector , Inspector 窗 口選擇： Acquisition-Analysis 分析；X Parameter 橫軸參數(shù)：FSC； Y Parameter 縱軸參數(shù)：CD3

35、PE;在圖中國門 R1 圈 上CD3+陽性的細胞；直方圖 HLA-B27 FITC/Counts，畫出一個新的直方圖后，在 Windows-show Inspector， Inspector 窗 口選擇：Acquisition-Analysis 分析；X Parameter 橫軸參數(shù)：FITC,選擇門 G1=R1選擇Maker工具，在直方圖中畫 M1,圈定所有細胞，選中這個直方圖，對直方圖進行統(tǒng)計-His-Stats，統(tǒng)計框中選擇 File Name、Maker label、%Gate Mean 和 Median；并且改 Plot 菜單 下的 Log dataUnit 屬性為 Chanel ,

36、 Acquire 菜單下 Acquisition & Storage 中的 Resolution 屬性為 256。設計試劑參數(shù)，在Acquire菜單中選擇Paarameter Description，在對話框中設定：P仁FSC P2=SSC, PS=HLA-B27 FITC, P4=CD3 PE。圖形設置完畢，選擇SAVE AS保存為HLA-B27 ACQ文件模板。聯(lián)機 Acquire-Connect to cytometer，出現(xiàn) Acquisition Control 窗口;數(shù)據(jù)獲取前的設定：Acquire-Accquisition &Storage- 設定獲取細胞數(shù)(10000-ALL)

37、-OKWindows-Browser 對話框選擇：-Directory設定存儲數(shù)據(jù)文件的文件夾；-File設定數(shù)據(jù)文件的名字：文件前綴（ Prefix ）-自定義；文件后綴（Surfix ）-管號;Cytometer-Detectors/VoltageCytometer-Instrument Setting-open 下找到并選擇Calibur file.B2711.3.5 樣本優(yōu)化實驗條件：AcquisitionCytometer-Detectors/VoltageCytometer-Instrument Setting-open 下找到并選擇Calibur file.B2711.3.5 樣

38、本優(yōu)化實驗條件：Acquisition(不能調(diào)節(jié)各熒光電壓和補償)：，在 Facstation G5BDfileInstrument 文件， Open-Set-Down.Control ? Setup-上樣-Acquire-進行實驗獲取條件的調(diào)整調(diào)整FSC SSC電壓使細胞完全顯示在FSC/SSC圖上；調(diào)整FSC閾值（Threshold）：減少碎片；調(diào)整FSC/CD3 PE中的R1,圈定需要分析的細胞（CD3+ ;調(diào)整HLA-B27/Counts中的M1,圈定所有細胞。（M1可以畫的大一些）可以保存經(jīng)樣本優(yōu)化過的實驗條件：Cytometer-Instrument Setting-Save保存實

39、驗獲取條件（InstrSet B27 ） -Done。順序上樣，獲取數(shù)據(jù)文件：Acquisition Control- DSetup-上樣-Acquire-儀器獲取足夠細胞后，自 動保存數(shù)據(jù)文件（data file ）。調(diào)節(jié)FSC/CD3 PE中R1的位置準確地圈定好需要分析的細胞；并同時調(diào)節(jié)HLA-B27/Counts中的M1,把所有細胞出現(xiàn)的峰全部圈住；His-Stats統(tǒng)計表中統(tǒng)計出B27的平均熒光，得出分析結(jié)果。輸入相關信息，保存并打印統(tǒng)計結(jié)果，退出程序。12. DNA測定材料和試劑抗凝外周血；DNA QC Particle , DNA測定質(zhì)量控制試劑盒（BD公司，349523） CE

40、N小雞紅細胞核，CTN小牛胸腺細胞核，2 Pm的熒光微球，核酸染料PI。CycleTEST PLUS DNA ReagentKit 試劑 A,試劑 B,試劑 C,緩沖液樣本制備質(zhì)控樣本的制備（DNA QC Particle ）CEN:輕輕搖勻后，吸取40 PL到1mL PI中，混勻室溫避光放置10分鐘，即可上機。CTN :大力震蕩試劑瓶，吸取40 PL到1mL PI中，混勻室溫避光放置10分鐘即可上機檢測。1222 外周血 DNA 羊本的制備（Cycle TEST PLUS DNA Reage nt Kit ）1222.1 將100 L抗凝外周血全加入17100-mm的管中加入1的溶血素2ml

41、,混勻，室溫放置10分鐘室溫300 g離心5分鐘，吸去上清液加入2mlPBS洗滌細胞1次，室溫3008離心5分鐘，吸取上清液加入250 PL A液，輕輕混勻，不要震蕩，室溫靜置10分鐘加入250 PL B液，輕輕混勻，不要震蕩，室溫靜置10分鐘加入250 PL C液，輕輕混勻，不要震蕩，低溫（28c ）避光靜置10分鐘用50 Pm尼龍網(wǎng)膜或35 P m細胞過濾器過濾細胞低溫避光放置以待上機檢測。建議在加入C液后3小時內(nèi)上機，上機前輕輕混勻細胞懸液。isition :用 CellQuest/CellQuest Pro 軟件獲取數(shù)據(jù)打開獲取模板（ACQ文件）或制作新模板：圖1 :選擇點圖，在窗口拖

42、出大小合適的方框，在出現(xiàn)的點圖對話框或Inspector中，選擇：Acquisition 獲取；X Parameter橫軸參數(shù)：FSC Y Parameter縱軸參數(shù)：SSC OK-出現(xiàn)相應的點 圖。圖2：選擇點圖，在窗口拖出大小合適的方框，在出現(xiàn)的點圖對話框或Inspector中，選擇：Acquisition 獲?。籜 Parameter 橫軸參數(shù)：FL2-W; Y Parameter 縱軸參數(shù)：FL2-A； OK-出現(xiàn)相應 的點圖。圖3：選擇直方圖，在窗口拖出大小合適的方框，在出現(xiàn)的直方圖對話框或Inspector中，選擇：Acquisition獲??；X Parameter橫軸參數(shù)：FL2

43、-A ； OK-出現(xiàn)相應的直方圖。在本圖橫軸200和400的位置分別設M門，標為M1和M2對此圖進行統(tǒng)計（Stats-Histogram Stats ），對M1和M2進行 統(tǒng)計：File name,Marker,%Gate,Mean,CV 。三個圖形都設置完畢，F(xiàn)ile中選擇SAVE AS保存模板ACQ文件。聯(lián)機 Acquire-Connect to cytometer，出現(xiàn) Acquisition Control 窗口，出現(xiàn) Acquisition Control 和 Browser窗口，先將Browser窗口最小化；數(shù)據(jù)獲取前的設定：Acquire-Accquisition &Storage-設定獲取細胞數(shù)（20000） -OK； Acquire-Parameter Discription 對話框（Browser 窗口最大化）選擇：-Directory :單擊Change設定存儲數(shù)據(jù)文件的文件夾；-File ：設定數(shù)據(jù)文件的名字：文件前綴（Prefix ）-自定義；文件后綴（Surfix ）-管號（設為1）,單擊 OK；打開獲取條件窗口，調(diào)出實驗獲