熒光定量PCR原理、應(yīng)用及Stratagene-Mx3000P介紹課件

1、實時熒光定量PCR原理及應(yīng)用上海吉泰生物科技有限公司裴杰萍內(nèi) 容 提 綱熒光定量PCR原理及應(yīng)用Stratagene Mx3000P熒光定量PCR儀常規(guī)核酸定量方法Southern 雜交Northern 雜交原位雜交傳統(tǒng) RT-PCR半定量 PCR存在的問題 靈敏度準確性特異性時間實時熒光定量PCR定義利用熒光信號對PCR反應(yīng)的過程進行實時監(jiān)控目的對起始模板進行定量 優(yōu)點 靈敏, 重復(fù)性, 動態(tài)范圍寬, 高通量原理 C(t)值與起始模板濃度的對數(shù)成反比什么是C(t)值C(t)Threshold（域值）為什么要引入C(t)值CtEndpoints96 replicates of B7 gene

2、molecular beacon1221利用電泳定量11,500 counts / 5200 counts = 2.2 fold difference如何定量標 準 曲 線 未 知 樣 品 的 C(t) 值 定量常用的熒光試劑SYBR Green ITMTaqMan / TaqMan-MGBMolecular Beacons MGB EclipseTM Probes Lux primersScorpionsTM AmplifluorQ-ZymeOthers.dsDNA DetectionTarget-specific DetectionSYBR Green I DetectionTaqMan

3、探針未結(jié)合的探針探針、引物與目的片段結(jié)合，F(xiàn)RET光發(fā)射或者以熱量形式散失Donor dye (Reporter)Acceptor dye (Quencher)LightEnergy transferTaqTaq 水解探針，報告熒光素與淬滅熒光素分離TaqLight EmissionLight熒光定量PCR應(yīng)用特異核酸（基因）定性、定量RNA (cDNA)基因表達差異分析基因芯片結(jié)果驗證DNA病原體定性與定量GMO (遺傳改良組織)檢測序列特異性等位基因分型, SNP 檢測應(yīng)用之一：病原體檢測與定量絕對定量（特異基因的拷貝數(shù)病原體的多少）標準品（如質(zhì)粒）：梯度稀釋未知樣品陰性對照（NTC）應(yīng)用

4、之一：病原體檢測與定量1432應(yīng)用之一：病原體檢測與定量應(yīng)用之二：基因表達差異分析相對定量：基因表達量上升或者表達被抑止的倍數(shù)兩種樣品：Calibrator（對照，如正常組織） 與Sample（待測樣品）兩個基因：目的基因與看家基因Normalizer看家基因應(yīng)用之二：基因表達差異分析CalibratorSampleGene of Interest目的基因CtCtCtCt Ct1 Ct2應(yīng)用之二：基因表達差異分析RNA抽提RT定量PCRcDNA產(chǎn)物系列稀釋兩個基因的擴增效率應(yīng)用之二：基因表達差異分析兩條探針分別針對不同等位基因ACGTACGT應(yīng)用之三：SNP分析應(yīng)用之三：SNP分析FAMTET

5、FAMTET應(yīng)用之三：SNP分析應(yīng)用之四：GMO檢測目的：檢測食品等中轉(zhuǎn)基因成分的含量大量的作物被遺傳改良來獲得一些性狀，如：抗除草劑，抗蟲，抗病等應(yīng)用之四：GMO檢測抗除草劑的轉(zhuǎn)基因大豆廣泛使用的除草劑的作用成分是草甘膦。草甘膦是EPSPS（5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶 ）的競爭抑制物。在草甘膦存在的條件下，EPSPS的活性被抑制。植物被轉(zhuǎn)化了一種耐受草甘膦的EPSPS基因，獲得抗性。 檢測策略抗性EPSPS基因的量 轉(zhuǎn)基因大豆的量 Lectin基因的量 食品中大豆總量應(yīng)用之四：GMO檢測 數(shù)據(jù)處理： C（t）EPSPS-C（t）LectinC（t） %GMO（1+E） Ct熒光定量P

6、CR儀的硬件條件激發(fā)光源熱循環(huán)加熱、制冷 樣品檢測設(shè)備熒光定量PCR儀應(yīng)滿足的要求光源的光譜范圍寬廣，能激發(fā)不同的熒光染料能分開不同熒光素的激發(fā)光與發(fā)射光波長能檢測的靈敏度與動態(tài)檢測范圍準確的溫度控制和良好的孔間溫度均一性.熒光定量PCR原理及應(yīng)用Stratagene Mx3000P熒光定量PCR儀Stratagenes New Mx3000P!High Performance Personal Price Stratagene 公司成立于1984年,致力于發(fā)展生命科學領(lǐng)域的創(chuàng)新產(chǎn)品與科技. 總部位于美國 La Jolla, California .在歐洲與日本設(shè)有分公司.Stratagene

7、 公司簡介Mx3000P 整體設(shè)計熱蓋熱循環(huán)系統(tǒng)石英鹵鎢燈發(fā)射光濾鏡輪激發(fā)光濾鏡輪光纖掃描臂Mx3000P 熱循環(huán)系統(tǒng)96 孔樣品槽半導(dǎo)體加熱制冷溫度均一性: +/- 0.25C升降溫速率: up to 2.5C/sec熱循環(huán)系統(tǒng)半導(dǎo)體加熱制冷 resistive and convective heat exchange獨特的溫度補償條，整板溫度均一性 +/- 0.25C熱蓋反應(yīng)體積10-100ulMx3000P 光路系統(tǒng)PMT96 well plate石英鹵鎢燈激發(fā)光濾鏡輪發(fā)射光濾鏡輪掃描式檢測同軸光纖Mx3000P 光學系統(tǒng)石英鹵鎢燈(350-750nm)2 個濾鏡輪可選擇的濾鏡:Filt

8、er sets: FAM/SYBR, HEX/JOE/VIC, ROX/Texas Red, Cy5, Alexa350, TET, NED/TAMRA, Cy31 PMT（光電倍增管）檢測器350-700nm 發(fā)射光檢測范圍掃描式檢測設(shè)計Mx3000P 掃描系統(tǒng)整板掃描3.5s濾鏡輪旋轉(zhuǎn)進行多通道掃描激發(fā)光源的比較Lasers: 光強高, 波長范圍窄；石英鹵鎢燈: 中等光強, 波長范圍寬；LED: 光強低, 波長受限制。Halogen LampLaserLEDAlx350FAMTETHEXJOEROXCy5Cy3TAMTxRdMx3000P 可用熒光染料發(fā)射光濾鏡發(fā)射光濾鏡熒光濾鏡系統(tǒng)ACB

9、Ex. Filter350 nm750 nm10 nm InterferenceABCMx3000P四通道設(shè)計，避免光譜重疊Mx3000P 發(fā)射光濾鏡輪熒光檢測系統(tǒng)的發(fā)展PMT光電倍增管冷CCDCCDPhotodiodes光電二極管熒光檢測系統(tǒng)靈敏度比較示意圖PMT (光電倍增管)冷 CCDCCDPhotodiodes光電二極管PMT與CCD的檢測原理 hvhve-e-PMTCCDCCD與PMT檢測區(qū)別無邊緣效應(yīng)邊緣效應(yīng)CCDMirrorSimultaneous Illumination/DetectionCCD與PMT檢測結(jié)果均一性對比Ct vs. Well number(across pl

10、ate groupings)Mx3000P均一性實驗 96 well uniformity run. SYBR Green I detection96 wellsMean Ct = 18.1St.Dev. = 0.05C.V . = 0.3%Ct Range = 0.26 cycles2-fold serial dilution (20,000 to 1.2 copies hgDNA. -Actin Mol. Beacon)Std. CurveR2 = 0.996Slope = -3.183Amplification Efficiency =106.1% Mx3000P的分辨率與靈敏度檢測圖。

11、10 x dynamic range, T7 hydrolysis probe, 8 replicates each concentration10 x dynamic range standard curve, Ct range 6-39, Rsq=0.999, Efficiency=98.6% Mx3000P檢測動態(tài)范圍檢測圖（高達十個數(shù)量級）。 Mx3000P Multiplex - 4 Color ResultFAM FAMHEXMx3000P Multiplex - 4 Color Result FAMHEXROXMx3000P 4通道實驗結(jié)果 FAMHEXROXCy5Mx3000P

12、 Multiplex - 4 Color ResultMx3000P 4通道標準曲線 利用FullVelocity 技術(shù)提高PCR運行速度最新的工程聚合酶 Archaeal (non-Taq) DNA polymerase 同樣具有優(yōu)越的: 靈敏度 特異性 可重復(fù)性FullVelocity(40 cycles)TIME SAVED!傳 統(tǒng) PCR (40 cycles)Mx3000P 軟件易學易用各種數(shù)據(jù)分析方式：自動分析或者手動分析支持熒光定量PCR的多種應(yīng)用模式多種應(yīng)用模式軟件的結(jié)構(gòu)PCR板的設(shè)定PCR程序設(shè)定運行時的狀態(tài)實時擴增數(shù)據(jù)軟件自行優(yōu)化的數(shù)據(jù)分析 Adaptive baselin

13、e correctionAmplification-based threshold標 準 曲 線相對定量Results Display4 fold down3 fold up基因分型結(jié)果顯示User defined genotypes, color coded populations, and automatic calling on text report“只讀板”實驗結(jié)果結(jié)果文本顯示Text Report or raw data can be exported to Excel or a text fileCustomize report多種格式輸出結(jié)果Text ReportExcel s

14、preadsheetPowerPoint presentationAny screen shotBrilliant QRT-PCR and QPCR ReagentsMaster mixes and reagent kits for any fluorescent chemistryCompatible with sequence-specific probesSYBR Green kitsDNA AmplificationBrilliant SYBR Green QPCR Master Mix Brilliant SYBR Green QPCR Core Reagent KitRNA Amp

15、lificationBrilliant SYBR Green QPCR Master Mix, 1-StepBrilliant SYBR Green QPCR ReagentsDNA AmplificationBrilliant QPCR Core Reagent Kit Brilliant Plus Core Reagent KitBrilliant QPCR Master Mix2-step RT-PCRRNA AmplificationBrilliant QRT-PCR Core Reagent Kit, 1 - StepBrilliant QRT-PCR Master Mix Kit,

16、 1 - StepBrilliant QRT-PCR Plus Core Reagent Kit, 1 - Step1-step RT-PCRBrilliant QRT-PCR Core Reagent Kit, 2 - StepBrilliant QRT-PCR Plus Core Reagent Kit, 2 - StepBrilliant Probe-based QPCR Reagents 2-fold discrimination using the Brilliant SYBR QPCR master mix on the Mx3000P instrumentCt variation

17、 0.5Cts10,000 copies5,000 copiesBrilliant QPCR KitsTarget = Beta actin / Template = Human genomic DNA36 wells of 10,000 copies with a Ct variation of 0.5 Cts and 36 wells of 5,000 copies with Ct variation of 0.5Cts引物探針設(shè)計軟件設(shè)計SYBR Green 引物, TaqMan 探針, FRET 探針和 Molecular beacons（分子信標）快速,簡單,功能強大獨特優(yōu)點能高效設(shè)

18、計雙標記探針(Taqman,FRET探針,分子信標等)優(yōu)化的引物設(shè)計能適應(yīng)不同的熒光定量PCR方法能進行等位基因分析與多重定量PCR探針設(shè)計有二級結(jié)構(gòu)分析功能,能圖形化顯示各種位置與結(jié)構(gòu)內(nèi)置BLAST連接BeaconDesigner 4.0 工作界面Fast Track QPCR 培訓項目優(yōu)勢：快速有效的 QPCR 培訓； 更高層次的QPCR應(yīng)用培訓； 能滿足客戶的不同要求； 從入門到高級的完全覆蓋；用戶能直接咨詢Stratagene的QPCR應(yīng)用 專家/fasttrackFast Track培訓內(nèi)容Web-seminar（網(wǎng)絡(luò)講座）Introduction to QPCR Guide（QPCR入門向?qū)В㏑egional QPCRUser Group Meetings（區(qū)域內(nèi)用戶會議）FAS（Field Application S