實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備、器皿及用具課件

1、第二章 實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備、器皿及用具白鳳麟2013.9.12一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)置二、實(shí)驗(yàn)室儀器三、實(shí)驗(yàn)室器皿及用具四、洗滌技術(shù)五、滅菌技術(shù)六、無菌操作技術(shù) 組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局的總體要求 便于隔離 便于操作 便于滅菌 便于觀察一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)置基本布局規(guī)律根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作程序排列實(shí)驗(yàn)室；接種室和培養(yǎng)室設(shè)在與外界環(huán)境隔離性好的區(qū)域；滅菌室與接種室相鄰；其他實(shí)驗(yàn)室的布局可根據(jù)條件，以方便使用為宜?；緦?shí)驗(yàn)室布局平面圖實(shí)驗(yàn)臺擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及儀器柜無菌臺無菌臺擱架拉窗冰箱擱 架水槽電爐門4.5m3.0m3.5m4.0m準(zhǔn)備室緩沖室無菌室培養(yǎng)室植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局示意圖培 養(yǎng) 室準(zhǔn) 備 室滅菌室儲藏室

2、接種室緩沖室組織培養(yǎng)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室1.準(zhǔn)備室1.1 洗滌間 根據(jù)工作量的大小決定其大小，一般面積控制在30-50m2。在實(shí)驗(yàn)室的一側(cè)設(shè)置專用的洗滌水槽，用來清洗玻璃器皿。中央實(shí)驗(yàn)臺還應(yīng)配置2個水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以購置一臺洗瓶機(jī)。準(zhǔn)備1-2個洗液缸，專門用于洗滌對潔凈度要求很高的玻璃器皿。此外還應(yīng)配置落水架、干燥箱、柜子、超聲波清洗器等。地面應(yīng)耐濕并排水良好。 面積60平方米左右，配備的主要儀器設(shè)備有 ：冰箱、天平、微波爐、pH計(jì)、培養(yǎng)基分裝器、藥品柜、器械柜、抽氣泵、電爐、各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管、燒杯、量筒、容量瓶、儲藏瓶等。冰箱以體積180-200L為宜，用于

3、儲存培養(yǎng)基母液、激素維生素等貴重藥品、彩色膠卷、及保存植物材料。天平應(yīng)有不同感量。1.2培養(yǎng)基配制間1.準(zhǔn)備室 配備實(shí)驗(yàn)臺、高壓滅菌鍋、排風(fēng)滅火設(shè)備、細(xì)菌過濾設(shè)備、干熱消毒柜、電爐等。滅菌鍋的選擇應(yīng)根據(jù)不同的要求選擇不同型號的滅菌鍋。一般實(shí)驗(yàn)室可選用小型的醫(yī)用手提式高壓滅菌鍋，較大的實(shí)驗(yàn)室可選用立式自動控制壓力和溫度的滅菌鍋。 生產(chǎn)性的實(shí)驗(yàn)室可選用大型的臥式滅菌鍋。 如果沒有條件的話，可以將上述工作間合并成一個準(zhǔn)備間，要求是設(shè)備的安裝和排列要合理、房間要寬敞、明亮、透風(fēng)，地面要便于清潔、防滑。1.3 消毒間1.準(zhǔn)備室 無菌操作室主要用于實(shí)驗(yàn)材料的接種操作，所以又叫接種室。通常由里外兩間組成，外

4、間是緩沖間，用于準(zhǔn)備工作，還有防止污染的作用。緩沖間的門應(yīng)該與接種室的門錯開，兩個門也不要同時開啟，以保證無菌室不因開門和人的進(jìn)出帶進(jìn)雜菌。緩沖間內(nèi)應(yīng)該設(shè)有水槽、實(shí)驗(yàn)臺、鞋帽架、和柜子、紫外燈。無菌操作室的內(nèi)壁應(yīng)當(dāng)用塑鋼板或瓷磚裝修，工作人員進(jìn)入操作間前要穿上消過毒的工作服和拖鞋。 室內(nèi)應(yīng)配有超凈工作臺，紫外燈、解剖鏡、各種接種器械等。 3. 無菌操作室無菌室無菌室 為了控制培養(yǎng)室的溫度和光照時間及其強(qiáng)度，培養(yǎng)室的房間不要窗戶，但應(yīng)當(dāng)留一個通氣窗，并安上排氣扇。室內(nèi)溫度由空調(diào)控制，光照由日光燈控制。天花板和內(nèi)墻最好用塑料鋼板裝修，地面用水磨石或瓷磚鋪設(shè)，一般要分兩間，一為光照培養(yǎng)室，一為暗培養(yǎng)

5、。培養(yǎng)室外應(yīng)有一預(yù)備間或走廊。 培養(yǎng)室應(yīng)配有培養(yǎng)架、轉(zhuǎn)床、搖床、光照培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、自動控時器等。日光燈一般用40W，固定在培養(yǎng)架的側(cè)面或擱板的下面，每層有兩支日光燈，距離在20cm，光照強(qiáng)度為2000-3000lx。4. 培養(yǎng)室設(shè)計(jì)組培實(shí)驗(yàn)室時的注意事項(xiàng)為了減少污染，實(shí)驗(yàn)室最好設(shè)一走廊且走廊上方最好安裝紫外燈；培養(yǎng)室最好設(shè)在南面，設(shè)大玻璃窗，以雙層玻璃窗為最好。如果培養(yǎng)室是設(shè)在房屋的邊側(cè)，其東邊或西邊的墻上也可設(shè)置大玻璃窗；培養(yǎng)室房間及門要小，而且密閉性要好，最好裝移門；無菌操作室要小，要設(shè)緩沖間，也最好裝移門，且門要稍大一些。酸度計(jì)電熱套天平2、滅菌設(shè)備 蒸汽壓力滅菌鍋、干熱消毒柜、過

6、濾滅菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈。蒸汽壓力滅菌鍋無菌瓶頂過濾裝置噴霧消毒器（參考圖）（參考圖）接種器具消毒器3、無菌操作設(shè)備 超凈工作臺4、細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備 搖 床培養(yǎng)架恒溫振蕩培養(yǎng)箱光照培養(yǎng)箱 5、細(xì)胞學(xué)鑒定設(shè)備 光學(xué)研究顯微鏡、實(shí)體顯微鏡、倒置顯微鏡倒置顯微鏡光學(xué)顯微鏡1、玻璃器皿三、培養(yǎng)器皿及實(shí)驗(yàn)用具培養(yǎng)皿三角瓶培養(yǎng)瓶2、金屬材質(zhì)用具鑷子解剖刀接種針1、玻璃器皿洗滌新購置玻璃器皿1%稀HCl浸漬12h洗衣粉洗滌清水沖洗晾干備用已用過的玻璃器皿四、洗滌技術(shù)清洗后器皿內(nèi)外不可掛有水珠，否則重洗，若重洗后仍掛有水珠，則需用洗液浸泡數(shù)小時后（或用去污粉擦洗），重新清洗。2、塑料用品洗滌新的塑料器皿打開

7、即用已用過的塑料器皿2%NaOH浸泡12h清水沖洗2%5%鹽酸浸泡30min清水沖洗蒸餾水沖洗晾干備用 金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌（新的可以用熱洗衣粉水洗凈），需要清洗時，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。 3、金屬用品洗滌（一）、滅菌工作是極其重要的。 首先應(yīng)建立有菌和無菌的概念有菌的范疇：有菌：凡是暴露在空氣中的物體，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、超凈工作臺的臺面，未處理的工具和手等。 無菌：高壓高溫處理（工具、器皿、培養(yǎng)基等） 物理或化學(xué)處理； 火烤后的物體； 健康的動植物不與內(nèi)外部表面接觸的組織 內(nèi)部可能是無菌的（有時也有內(nèi)生菌，但 不會影響培養(yǎng)，也不會污染）五. 滅菌技術(shù)1、

8、物理方法：干熱、濕熱、過濾（0.25微米）紫外燈、超聲波等。 2、化學(xué)方法：使用滅菌劑或抗菌素，如酒精、次氯酸鈉、升汞、漂白粉、高錳酸鉀、雙氧水、福爾馬林等。 五. 滅菌技術(shù)干熱滅菌 玻璃器皿、器械 濕熱滅菌 培養(yǎng)基、蒸餾水、器械、棉塞等熏蒸滅菌 接種室、培養(yǎng)室過濾滅菌 液體培養(yǎng)基、蒸餾水藥劑滅菌 培養(yǎng)材料燒灼滅菌 器械、瓶口、棉塞、包頭紙輻射滅菌 接種室、培養(yǎng)間（一）各種滅菌方法及其使用范圍 適用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。操作方法：150 、40min或120 、120min，如果發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌，160 、90120min（1）干熱滅菌 適用于各種器皿、培養(yǎng)基、器皿、蒸餾水、棉塞、紙等。12

9、1 維持2030min注意點(diǎn)：加足水、排盡氣、氣壓降到0時，才能開蓋。（2）濕熱滅菌 培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解（如某些生長調(diào)節(jié)劑GA3、玉米素等），就需要過濾滅菌。另外酶、血清等也需要過濾滅菌。 滅菌方法：將生長調(diào)節(jié)劑或酶配成一定濃度，用注射器注入微孔濾膜慮，濾膜孔徑0.220.45微米。制培養(yǎng)基時，現(xiàn)將培養(yǎng)基高壓滅菌，待降至50左右時，加入適量的激素，然后分裝。（3）過濾滅菌 主要是利用紫外燈進(jìn)行照射，適合實(shí)驗(yàn)室空氣、操作臺等，滅菌時間2030min。注意：關(guān)燈后5min后再進(jìn)入。超凈工作臺關(guān)燈后要打開風(fēng)機(jī)。（4）射線滅菌 用火焰灼燒達(dá)到滅菌目的，適

10、用于接種器皿的滅菌。（5）火焰灼燒滅菌適用外植體、實(shí)驗(yàn)器皿、操作表面、皮膚等。幾種常用消毒劑的效果比較消 毒 劑使用濃度(%)消毒時間(min.)效 果殘液去除難易乙醇70-750.1-3好易新潔爾滅1020530好易氯化汞0.11215最好最難過氧化氫1012515較好最易抗菌素450mgl-13060較好較難次氯酸鈣/納9 10530好易（6）消毒劑 長期不用的培養(yǎng)室或接種室要進(jìn)行熏蒸。方法：甲醛、高錳酸鉀熏蒸。 甲醛的用量通常按每立方米空間2-6毫升計(jì)算，高錳酸鉀的用量是甲醛的一半。室內(nèi)準(zhǔn)備妥當(dāng)后，把稱好的高錳酸鉀放在瓷碗或燒杯內(nèi)(最好在碗或杯下面鋪一張報紙，以利清洗)，然后將甲醛也倒入

11、碗或杯內(nèi)，立即出屋關(guān)門。幾秒鐘后，甲醛溶液即沸騰揮發(fā)。高錳酸鉀是一種氧化劑，當(dāng)它與一部分甲醛作用時，由氧化反應(yīng)產(chǎn)生的熱可使其余的甲醛揮發(fā)為氣體。（7）熏蒸滅菌 甲醛熏蒸接種室應(yīng)至少在使用前24小時進(jìn)行，熏蒸后密閉保持4小時以上再進(jìn)入室內(nèi)工作。甲醛對人的眼、鼻有強(qiáng)烈刺激作用。因此，可在使用前用氨進(jìn)行中和。取與甲醛等量的氨水，倒在另一個燒杯里，迅速放入熏蒸室內(nèi)，使甲醛和氨水發(fā)生中和反應(yīng)，以消除甲醛味，減少對人體的刺激作用。使用氨水應(yīng)在工作前2小時進(jìn)行。 對有材料的培養(yǎng)室，也可以采用乙二醇加熱熏蒸。（二）接種室滅菌空氣消毒滅菌接種室超凈工作臺紫外燈照射70%75%的酒精擦洗培養(yǎng)材料的接種紫外燈照射（

12、三）外植體滅菌流水沖洗1020min或更長時間70%75%酒精中浸泡30s0.1%0.2%氯化汞液中浸泡10min左右蒸餾水沖洗45次在10%的次氯酸鈉、飽和漂白粉浸泡30min左右備用常用消毒劑消毒滅菌比較表消毒劑使用濃度（%）去除難易消毒時間（min）效果次氯酸鈣次氯酸鈉漂白粉溴水過氧化氫升汞酒精抗生素硝酸銀9102飽和溶液1210120.11707545（mg/L1易易易易最易較難易中較難5305305302105152100.223060530很好很好很好很好好最好好較好好污染來源人為因素（工作人員本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素器皿和用具培養(yǎng)皿：洗熱壓 玻璃器皿：洗干熱（

13、干熱箱）或晾干 接種用具：用CCL4布擦濕布擦 泡75%95%酒精燒培養(yǎng)基：濕熱培養(yǎng)材料外部細(xì)菌：用水沖洗化學(xué)藥劑處理 內(nèi)部細(xì)菌 莖尖培養(yǎng) 加抗生素：青霉素、利福平操作的空氣：洗刷地板95%酒精擦超凈工作臺 用化學(xué)試劑薰蒸六、無菌操作技術(shù)1、實(shí)驗(yàn)器具和材料的準(zhǔn)備2、用75%的酒精擦拭超凈工作臺，然后室內(nèi)及超凈工作臺用紫外燈殺菌20min-30min。注意：臺面上的用品不要放置太多或重疊放置，以免降低滅菌效果。3、關(guān)紫外燈、打開風(fēng)機(jī)，過5-10min進(jìn)入緩沖間，以75%洗手和手臂，更換無菌服、帽子和口罩。進(jìn)入接種室。（注：沒有特別情況，盡量不要下工作臺）六、無菌操作技術(shù)4、用7075的酒精拭擦臺

14、面并消毒雙手。試驗(yàn)用具也應(yīng)該用酒精消毒。點(diǎn)燃酒精燈，將金屬器械在其火焰上灼燒，冷卻待用。注意：所有操作應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過灼燒進(jìn)行。金屬器械不能過度灼燒，以防退火。移液管不能灼燒，培養(yǎng)瓶口、塑料材料、橡膠材料過火焰不能時間太長。5、取流水沖洗（至少30min）過的外植體，用一定的消毒劑浸泡消毒，用無菌水沖洗34次，放入無菌培養(yǎng)皿中，置于酒精燈火焰下方，用無菌的接種器械進(jìn)行分離、切割或其他處理。6、打開培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用鑷子將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上，灼燒鑷子放回，灼燒瓶口，蓋上瓶塞。7、用酒精擦洗工作臺和手。進(jìn)行下一輪操作。注意（1）進(jìn)行培養(yǎng)時，動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流

15、動，增加污染機(jī)會。（2）不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。 （3）為拿取方便，工作臺面上的用品要有合理的布局，原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央。（4）工作由始至終要保持一定順序性，組織或細(xì)胞在未做處理之前，勿過早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在未用前，不要過早開瓶；用過之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口直立可增加落菌機(jī)會。（5）吸取營養(yǎng)液、細(xì)胞懸液及其它各種用液時，均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴(kuò)大污染或?qū)е录?xì)胞交叉污染。（6）工作中不能面向操作區(qū)講話或咳嗽，以免唾沫把細(xì)菌或支原體帶入工作臺面發(fā)生污染。（7）手或相對較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液時如吸管尖碰到瓶口，則應(yīng)將吸管丟掉。接種時在近火焰處打開瓶口，使瓶傾斜，以免空氣中微生物落入瓶中。正 確錯 誤