病原菌的分離培養(yǎng)和純化

1、普通植物病理學(xué)實驗十七、病原菌得分離壇養(yǎng)與純化一、目得要求了解分離與純化微生物得基本原理及方法。掌握倒平板得方法與組織分離、稀釋分離、平板劃線分離得基木操作技術(shù)。掌握在平板、斜而及液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)病原菌及觀察其培養(yǎng)性狀得方法。二、基木原理植物病原菌得分離培養(yǎng),就是植物病理實驗室工作中得基本技能。為了獲得某微生物得純 培養(yǎng)，一般就是根據(jù)該微生物關(guān)于營養(yǎng)、酸堿度、氧氣等條件要求不同，而供給它 們適宜得生活條件， 即讓病原菌生活在適宜得培養(yǎng)基上，或加入某種克制劑造成只利于此菌生長，而克制其她菌生長得環(huán) 境，從而得到純菌株。植物病原真菌得分離方法主要有組織分離法與稀釋分離法兩種。最常用得方法 就是組織

2、分離法，而稀釋分離法主要用于病組織上產(chǎn)生大量抱子得病原真菌得分離。病原細(xì)菌得分離 方法以劃線分離法為最常用，在有些情況下也采用稀釋分離法。為了獲得分離菌得純培養(yǎng)，必需要進(jìn) 行分離菌得純化，純化得方法類似于分離工作中采用得稀釋分離法或劃線分離法。三、材料、儀器與用具1材料(依當(dāng)?shù)厍闆r進(jìn)行選擇，下列材料供參)(pyricu 1 a ria orycae)o(exserohum t urcicum)。玉米彎抱菌葉斑病葉(c u r V u laria 1 u n ata)o(4 )玉米小斑病葉(bipo I aris may is L(5) 番茄灰霊病果(botrvt i s cinefca)。(6

3、(scicrotinia s c 1(7(pseu 0 monerolio r as syringa e pv.lach r y mans) o(8)水稻白葉枯病葉(xanth omonascampe s tmspv、o r ycuc)。大豆細(xì)菌性斑點病葉(psc U omonas syringacpv. g ly c i n ca)o（10）白菜軟腐病葉（eru niacar otovora sub sp.c arotovora） 2培養(yǎng)基pa培養(yǎng) 基肉胃蛋白腺培養(yǎng);加寄主組織煎汁得培養(yǎng)基等。3 儀器與用品超鏡工作臺、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、吸管、吸水紙、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、檢子、接種鏟（針）

4、、接種環(huán)（銀）70%酒精、01 %升汞、酒精燈、火柴、記號筆、橡皮筋套、可調(diào)式電爐、鍋等0 升汞溶液配:升汞1 e濃鹽酸2.5 ml蒸慵水1000m 1 o先將升汞溶于鹽酸中待充分溶解后，再加水稀釋。升汞就是劇毒藥物，在操作時應(yīng)待別小心。四、實驗操作（一）病原貞菌得分離組織分離法依照以下步驟進(jìn)行:（1）取火菌培養(yǎng)皿一個置于濕紗布上，在皿蓋上用玻璃鉛筆注明分離日期、材料與分離人得姓名。提示:為了保證無菌操作，應(yīng)注意下而幾點：工作前最好將所需得物品都放在超凈工作臺內(nèi)，工 作中臨時去取容易帶來雜菌;保證工作人員自身得潔凈,工作前用肥皂洗手：無菌操作前還要用 7 0%酒 精擦拭雙手;工作中，特別在使用

5、無菌操作間時，呼吸要輕，不要說話。（2）252（可減少細(xì)菌污染），Ocpa1015m 2520多黏霉素b （5 0 ug/ml）可以克制g（40 g/ml（50ug/ni 1 ）可以克制大部分細(xì)菌得生長。除了氯每素可在滅菌前加入外，45c（）平板進(jìn)程中只要遵循“穩(wěn)、輕、快要領(lǐng)，不必在火焰上方，一般很少污染。（3）取真菌葉斑病得新鮮病葉（或其她分離材料）選擇典范得單個病斑，用剪刀或解剖刀從病斑邊緣（病健交界處）切取小塊（海邊長 3- 4mm）病組織數(shù)塊。提示 :選擇新想病得組織作為分離 得材料，可以減少腐生菌混入得機會。腐生菌一般在發(fā)病很久而已經(jīng)枯死或腐敗得部分滋生,因此，一 般斑點病害應(yīng)在臨近

6、健全組織得部分分離。將病組織放人70%灑精中浸3-5 S后,按無菌操作法將病組織務(wù)人0. 1%升汞液中訣別表面消毒05、1、2. 3. 5rain(也可使用其她表而消毒)，如植物組織柔嫩唄9表而消毒703s理得時間較短(一般數(shù)秒至lmin)o30S30min3, 5mmo用無菌操作法將病組織移至平板培養(yǎng)基上，毎皿內(nèi)放46塊。提示:在將病組織小塊移放到平板面之前，應(yīng)將其在無菌吸水紙上吸去多余得水，以大大減少病組織附近出現(xiàn)細(xì)菌污染。2512034若病組織小塊上均長岀較為一致得菌落，則多半為要分離得病原菌。在無菌條件下，用25C離工作。2稀釋分離法00ml。到第二個培養(yǎng)IIIL4550c1 225%

7、乳酸)搖勻，凝固，要使培養(yǎng)基與稀釋得菌液充分混勻提示 :倒平 板時得培養(yǎng)基溫度一泄要掌握好，過熱易將病原菌盪死而使分離失敗，過冷則倒入培養(yǎng)皿中后難以形成 平板4 5 5 Oco(251 3(6)挑菌。將培25C病組織材料進(jìn)行細(xì)菌學(xué)初步診斷即經(jīng)過鏡檢確認(rèn)有噴菌現(xiàn)象以后才關(guān)于該病組織作分離工 作。稀釋分離法就是彊經(jīng)典得標(biāo)準(zhǔn)分離法，方法同上述真菌分離。除去上述稀釋分離法以外，較為方便得就是劃線分離法:預(yù)先把熔化好得肉膏蛋白腺培養(yǎng)基倒在培養(yǎng)皿中，凝成平板后，翻轉(zhuǎn)放在30c恒溫箱中2-4h表面無水滴凝結(jié)。也可凝成平板后宜接使用。將病組織先用0升汞表而消毒05-2mini再用無菌水換洗3次后，放在火菌培養(yǎng)

8、中得滅菌水中，用滅菌玻棒研碎，并且讓組織碎塊在水中浸泡2 0-60m i 讓細(xì)菌釋放到火菌水中 0用滅菌得接種鋼（接種環(huán)）薩取浸泡液在干燥得培養(yǎng)基平板表而劃線，盡快不要把平板表批線與第二批線上得細(xì)菌數(shù)量相差很大。1 -3仔細(xì)挑取病原菌得單菌落，并且移植到斜而培養(yǎng)基上。同時，再把單菌落用滅菌水稀釋成懸浮己獲得純培養(yǎng)。最好要經(jīng)過連續(xù)三次單菌落得分離，才能確保純化。（三）真菌、細(xì)菌培養(yǎng)性狀觀察1真菌培養(yǎng)性狀觀察取己分離、純化得某種真菌菌種按前述稀釋分離法中（ 1）-（5）透到培養(yǎng)基中、菌落生長速度快慢等。同時要記載培養(yǎng)基種類（成分及ph）與培養(yǎng)溫度、光照條件。2 細(xì)菌培養(yǎng)性狀觀察殊氣味形成等。同時要

9、記載培養(yǎng)基種類（成分及P h）與培養(yǎng)溫度、光照條件。用接種銀（環(huán)）醮細(xì)菌菌種后，經(jīng)過無菌操作在肉膏蛋口陳等斜而培養(yǎng)基表面從下向上劃一23（成分及ph）0用接種鉗（環(huán)）養(yǎng)基中就是否變混濁、就是否有色素、氣體、沉淀生成培養(yǎng)液表而就是否可生成菌膜等。也要 記載培養(yǎng)基種類（成分及ph）與培養(yǎng)溫度、光照條件。五、所需時間流程病原真菌分離組織分離：切取病組織，表而消毒，無菌水洗移人平板稀釋分:配子懸液倒平板i I培養(yǎng)7-1 0 分離菌移人斜面30min培養(yǎng)7-1 O檢査斜而上分離菌產(chǎn)砲30mm保存菌種2病原細(xì)菌分離劃線分離:倒平板沾菌懸液劃線.12稀釋分離3.病原真菌、細(xì)菌菌落培養(yǎng)性狀觀察平板上形成單菌落

10、1 3觀察迦些寫報告4病原細(xì)菌菌苔培養(yǎng)性狀觀察斜而上形成菌苔i3觀30min寫報告5病原細(xì)菌液體培養(yǎng)性狀觀察接菌于液體培養(yǎng)基30m i n培養(yǎng)2-3觀察3 0 min寫報六、實驗作業(yè)1、上交分離得病原真菌、細(xì)菌菌種。七、思考題1如果要分離得病原真菌就是鞭毛菌中得腐德菌、疫瞪菌等應(yīng)當(dāng)如何進(jìn)行才會獲得更好得效果？2在分離病原貞菌時，向平板培養(yǎng)基中加人乳酸為什么會大大減少細(xì)菌得污染？3如果要從土壤中分離某種病原菌，應(yīng)當(dāng)采取什么樣得分離方法會更有效？4.觀察記載頁菌及細(xì)菌得培養(yǎng)性狀有何意義？怎樣才能知道您獲得得病原真菌、細(xì)菌菌種就是否就是純培養(yǎng)？附 1 常用得幾種典范得病原菌分離方法1 斑點病原菌得分離。從病斑部分切取每邊3-5mn得小塊組織，在70%灑精中浸數(shù)秒鐘后，移人0J %得升汞水溶液中處理 3-5 r aim 以滅菌水沖洗 3 次，移置培養(yǎng)皿得培養(yǎng)基中，然7096菌水沖洗幾次，移脊培養(yǎng)基而上。得分離法，材料大得則可以用維管束組織內(nèi)病原得分離法。4肉質(zhì)組織中病原菌得分離。多肉得根、莖及果實等，可以采用維管朿組織內(nèi)病菌分離法除去表面組織，切取小塊病組織分離。如有雜菌感染可采用“直接接種法，待出現(xiàn)癥狀后，用此法再行分 離。5 種子內(nèi)病原菌分離。將整