蛋白質(zhì)純化的方法選擇

1、前言蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中一般都是以簡單的混合物形式存在單獨(dú)的或一套現(xiàn)成的方法能把任何一種蛋白質(zhì)從簡單的混合物中提取出來白質(zhì)都有可能選擇一套適當(dāng)?shù)姆謩e提純程序來獵取高純度的制品。蛋白質(zhì)提純的總目標(biāo)是設(shè)法增加制品純度或比活性，對純化的要求是以合理的效率、速度、 仍保存有這種多肽的生物學(xué)活性和化學(xué)完整性。能從成千上萬種蛋白質(zhì)混合物中純化出一種蛋白質(zhì)的緣由 螺旋、 折疊和各種轉(zhuǎn)角、三級構(gòu)造和四級構(gòu)造，形成獨(dú)特的大小、外形和殘基在蛋白質(zhì)外表的分布狀況，利用待分別的蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)之間在性質(zhì)的差異，即能設(shè)計(jì)出一組合理的分級分別步驟。 可依據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)與之相對應(yīng)的方法將蛋白質(zhì)混合物分別：分子大小到分別

2、透析和超濾透析在純化中極為常用，可去除鹽類脫鹽及置換緩沖液透析在純化中極為常用，可去除鹽類脫鹽及置換緩沖液、有機(jī)溶劑 低分子量抑制劑等。一下的酶液就有就有泄露的危急，在純化中極為常用，可去除鹽類、有機(jī)溶劑 低分子量抑制劑等超濾一般用于濃縮和脫色12 離心分別置換緩沖液1020 倍，再對特定的酶進(jìn)展純化。差速離心，區(qū)分率較低，僅適用于粗提或濃縮。速率區(qū)帶法，如離心時(shí)備。等密度梯度離心常用的離主介質(zhì)有蔗糖、聚蔗糖、氯化銫、溴化鉀、碘化鈉等等。13 凝膠過濾這是依據(jù)分子大小分別蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一熱源。外形蛋白質(zhì)在離心通過溶液運(yùn)動時(shí)，或通過膜、凝膠過濾填料顆?；螂娪灸z中的小孔運(yùn)動時(shí)， 斯

3、托克半徑，通過溶液沉降時(shí)遇到的摩擦力小，沉降較快而顯得比其它外形的蛋白質(zhì)大；反 部，較遲洗脫出來，因而顯得比其它外形的蛋白質(zhì)要小。溶解度利用蛋白質(zhì)的溶解度的差異來分別各種蛋白質(zhì)常用的方法，其中主要有：溶液的pH、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度，但在同一的特定外界條件下， 度。pH 把握和等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)一般較不易溶解。蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析有機(jī)溶劑分級法蛋白質(zhì)在不同的溶劑中的溶解度有很大不同，從根本不溶10g/m直至極易溶解 300mg/mlpH、溶劑的極性、離子性質(zhì)和 離子強(qiáng)度。引起蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同，故把握有機(jī)溶劑的濃度可分別蛋白質(zhì)。水溶性非離子聚合物如聚乙二醇也能引起蛋白質(zhì)的

4、沉淀。溫度分別操作一般在0或更低溫度下進(jìn)展。4電荷蛋白質(zhì)凈電荷取決于氨基酸殘基所帶的正負(fù)電荷的總和性蛋白質(zhì)，電泳不僅是分別蛋白質(zhì)混合物和鑒定蛋白質(zhì)純度的重要手段方法。等電聚焦區(qū)分率很高，pI 有0.02pH 的差異就能分開。2D- 分別蛋白質(zhì)區(qū)分率已經(jīng)進(jìn)展到100000 個蛋白點(diǎn)。離子交換層析轉(zhuǎn)變蛋白質(zhì)混合物溶液中的鹽離子強(qiáng)度、pH 和陰、陽離子交換填料，不同蛋白質(zhì)對不同的離子交換填料的吸附容量不同，蛋白質(zhì)因吸附容量不同或不被吸附而分別。pH 種可分分段洗脫和梯度洗脫。梯度洗脫一般效果好，區(qū)分率高，特別是使用交換容量小，對鹽濃度敏感的離子交換劑，多用梯度洗脫。把握洗脫劑的體積與柱床體體積相比、

5、鹽濃度和 pH，樣品組分能從離子交換柱上分別洗脫下來。蛋白分子暴露在外外表的側(cè)鏈基團(tuán)的種類和數(shù)量不同，故在肯定的PH 值和離子強(qiáng)度的緩沖液的所帶的電荷不同。電荷分布電荷的氨基酸殘基可均勻地分布于蛋白質(zhì)的外表pH 與陽離子交換樹脂或陰離子交換樹脂結(jié)合，如鈣調(diào)蛋白只能在pH2 時(shí)與陽離子交換樹脂結(jié)合。疏水性酸殘基的數(shù)目和空間分布打算了該蛋白質(zhì)是否具有與疏水柱填料結(jié)合從而利用它來進(jìn)展分 適用于濃硫酸銨溶液沉淀分別后的母液以及該沉淀用鹽溶解后的含有目標(biāo)產(chǎn)品的溶液直 7mol/鹽酸胍或8mol/L 脲的大腸桿菌的治療蛋白質(zhì)提取液直接進(jìn)樣到柱上，在分別的同時(shí)也進(jìn)展了復(fù)性。密度多數(shù)蛋白質(zhì)的密度在1.31.4

6、g/cm3 之間，分級分別蛋白質(zhì)時(shí)一般不常用此性質(zhì)，不過對含有大量磷酸鹽或脂質(zhì)的蛋白質(zhì)與一般蛋白質(zhì)在密度上明顯不同蛋白質(zhì)分別?；蚬こ虡?gòu)建的純化標(biāo)記通過轉(zhuǎn)變 cDNA 在被表達(dá)的蛋白的氨基端或羧基端參加少許幾個額外氨基酸，這個參加的標(biāo)記可用來作為一個有效的純化依據(jù)。GST 融合載體使要表達(dá)的蛋白質(zhì)和谷胱甘肽S Glutathione Sepharose 4B 作親和純化，再利用凝血酶或因子Xa 切開。蛋白A 融合載體使要表達(dá)的蛋白和蛋白A IgG 結(jié)合部位融合在一起表達(dá)，以IgG Sepharose 純化。含組氨酸標(biāo)記Histidine-taggedChelating Sepharose610

7、 如8M 尿素下借助它能與Ni2+螯合柱緊緊結(jié)合的力量，用咪唑洗脫，或?qū)H 降至5.9 使組氨酸充分質(zhì)子化，不再與結(jié)合Ni2+使之得以純化。技術(shù)STREAMLINE 適合做粗分別。親和力量結(jié)合效率高，分別速度快的特點(diǎn)。配基可是酶的底物、抑制劑、輔因子、特異性的抗體。吸附后可轉(zhuǎn)變緩沖液的離子強(qiáng)度和PH 的方法，洗耳恭聽脫下來，也可用更高濃度的同一配體溶液或親和力更強(qiáng)的配體溶液洗脫。親和層析固定相的配基與生物分子之間的特別的生物大分子親和力量不同來進(jìn)展相互分別 專一 性 吸附一些雜蛋白質(zhì)，另洗脫過程中的配體不行避開的脫落進(jìn)入分別體系。與超濾結(jié)合起來， 將兩者優(yōu)點(diǎn)集中形成超濾親和純化 按配基的不同

8、可分為：1金屬螯合介質(zhì)過渡金屬離子Cu2、Zn2和 Ni 2含有這些氨基酸的蛋白被這種金屬螯合親和色譜的固定相吸附pH 蛋白質(zhì)相互分別。小配體親和介質(zhì)配體有精氨酸、苯甲酰胺、鈣調(diào)因子、明膠、肝素和賴氨酸等等?？贵w親和介質(zhì)即免疫親和層析，配體有重組蛋白A 和重組蛋白G，但蛋白A 比蛋白G 專一，蛋白G 能結(jié)合更多不同源的IgG。顏料親和介質(zhì)強(qiáng)度、PH 值及待分別的樣品的純度有關(guān)。配體有Cibacron Blue 和Procion Red 兩種。離子強(qiáng)度小于0。1 和PH 大于7 時(shí)操作。外源凝集素親和介質(zhì)發(fā)生可逆反響，適合純化多糖、糖蛋白。非極性基團(tuán)之間作用力非選擇性分散力或倫敦力大小 與溶質(zhì)分

9、子極性基團(tuán)與流淌力相中極性分子在相反方向上相互作用力的差異進(jìn)展分別 流淌相中的置換劑是極性小于水的有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈、四氫呋喃等，這些有機(jī)溶劑可能使很多蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生不行逆的變性；流淌相中須有離子對試劑如三氟乙酸、甲酸、磷酸等一 般pH 在23 之間，又有一些蛋白質(zhì)會在后兩種條件下產(chǎn)生不行逆的分子構(gòu)象變化，故在生物大分子中人分別純化中受到限制，但分子構(gòu)象變化可逆的蛋白質(zhì)而言是有效的方法。 正相色譜在生物大分子中的分別和純化中應(yīng)用相對較少，因所用的溶劑很貴。 11可逆性締合在某些溶液條件下，有一些酶能聚合成二聚體、四聚體等，而在另一種條件下則形成單體， 如相繼在這兩種不同的條件下按大小就可以進(jìn)

10、展分級分別。穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性大多數(shù)蛋白質(zhì)加熱到95仍保持其可溶性活性的蛋白質(zhì)從大局部其它細(xì)胞蛋白質(zhì)中分別開。蛋白酶解穩(wěn)定性用蛋白酶處理上清液，消化雜蛋白，留下抗蛋白酶解抗性蛋白質(zhì)。安排系數(shù)即利用雙水相萃取分別，常用的生物物質(zhì)分別體系有：聚乙二醇PEG/葡聚糖DEXTRAPEGPEG對酶無毒性、分別設(shè)備與化學(xué)工業(yè)通用等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)上日益受重視。安排行為受聚合物分子大小、成相濃度、PH、無機(jī)鹽種類等因素影響。 進(jìn)展：具有親和雙水相萃取及膜分別雙水相萃取等型雙水相分別技術(shù)。雙向水溶液系統(tǒng)的蛋白質(zhì)純化一些與水混合多聚物的不相溶性導(dǎo)致依靠于多聚物濃度的兩相系統(tǒng)的液-液安排技術(shù)，可以 由兩不同的高水溶性的多

11、聚物或一種多聚物各一種鹽，用于從微生物勻漿中除支細(xì)胞碎片、后續(xù)安排步驟進(jìn)一步純化。分別的選擇性一般隨著分別分子或顆粒大小面增加。 14外表活性泡沫分別和濃縮的目的。反膠團(tuán)相轉(zhuǎn)移法反膠團(tuán)相轉(zhuǎn)移法是80 年月興起的一種型分別技術(shù)，它利用外表活性劑分子在有機(jī)溶劑中自發(fā)形成的反向膠團(tuán)反膠團(tuán)，在肯定條件下將水溶性蛋白質(zhì)分子增溶進(jìn)反膠團(tuán)的極性核水池中，再制造條件將蛋白質(zhì)抽提至另一水相，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的相轉(zhuǎn)移 pH 值及離子強(qiáng)度等因素均影響反膠團(tuán)對蛋白質(zhì)的相轉(zhuǎn)移。據(jù)報(bào)道利用AOT異辛烷反膠團(tuán)對酵母脂肪 酶進(jìn)展相轉(zhuǎn)移。聚合物-鹽-水液-固苯取體系聚合物-鹽-水液-固苯取體系是90 年月在國內(nèi)開發(fā)的種的萃取體系，成

12、功地用于萃取金屬酶的純化，通過共價(jià)鍵結(jié)合在層析介質(zhì)上，偶聯(lián)是可逆的，能復(fù)原二硫鍵的低分子化蛋白質(zhì)分別純化的一般程序蛋白質(zhì)分別純化的一般程序可分為以下幾個步驟：一材料的預(yù)處理及細(xì)胞裂開分別提純某一種蛋白質(zhì)時(shí)，首先要把蛋白質(zhì)從組織或細(xì)胞中釋放出來并保持原來的自然狀 機(jī)械裂開法這種方法是利用機(jī)械力的剪切作用，使細(xì)胞裂開。常用設(shè)備有，高速組織搗碎機(jī)、勻漿器、研缽等。滲透裂開法這種方法是在低滲條件使細(xì)胞溶脹而裂開。反復(fù)凍融法溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜承受此法。超聲波法使用超聲波震蕩器使細(xì)胞膜上所受張力不均而使細(xì)胞裂開。酶法如用溶菌酶破壞微生物細(xì)胞等。(二) 蛋白質(zhì)的抽提通常選擇適當(dāng)?shù)木彌_液溶劑把蛋白質(zhì)提取

13、出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強(qiáng)度、組成成 tritonX-100 等在抽提過程中，應(yīng)留意溫度，避開猛烈攪拌等，以防止蛋白質(zhì)的變性。三蛋白質(zhì)粗制品的獲得選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|(zhì)與其它雜蛋白分別開來溶解度的差異進(jìn)展的分別。常用的有以下幾種方法：等電點(diǎn)沉淀法不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，可用等電點(diǎn)沉淀法使它們相互分別。鹽析法析沉淀下來的蛋白質(zhì)仍保持其自然性質(zhì)，并能再度溶解而不變性。有機(jī)溶劑沉淀法溶解度降低，進(jìn)而從溶液中沉淀出來，因此可用來沉淀蛋白質(zhì)。此外該法時(shí)，要留意在低溫下操作，選擇適宜的有機(jī)溶劑濃度。四樣品的進(jìn)一步分別純化 析等等。有時(shí)還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)樣品。五紫

14、外吸取法測蛋白質(zhì)含量五紫外吸取法測蛋白質(zhì)含量 外光的性質(zhì)。吸取頂峰在280nm 處，其吸光度即光密度值與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm 的光吸取值與肽鍵含量成正比。利用肯定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸取不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的NH42SO4 等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，由于此時(shí)只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其確定值。結(jié)果還是存在肯定的誤差。pH 溶液的pH 值，測定樣品時(shí)的pH 要與測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH 相全都。280nm 的光吸取法因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm 處具有最大吸取

15、，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差異不大，因此測定蛋白質(zhì)溶液在280nm 處的吸光度值是最常用的紫外吸取法。測定時(shí)，將待測蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑水或緩沖液作空白比照，在紫外分光度計(jì)上直接讀取280nm 的吸光度值A(chǔ)280。蛋白質(zhì)濃度 可把握在0.11.0mg/ml 左右。通常用1cm 光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿，盛有濃度為1mg/ml 的蛋白質(zhì)溶液時(shí)，A280 約為1.0 左右。由此可馬上計(jì)算出蛋白質(zhì)的大致濃度。很多蛋白質(zhì)在肯定濃度和肯定波長下的光吸取值A(chǔ)11cm有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可查，依據(jù)此光 吸取值可以較準(zhǔn)確地計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。下式列出了蛋白質(zhì)濃度與A11cm值即蛋白 質(zhì)溶液

16、濃度為1%，光徑為1cm 時(shí)的光吸取值的關(guān)系。文獻(xiàn)值A(chǔ)11cm, 稱為百分吸取系數(shù)或比吸取系數(shù)。蛋白質(zhì)濃度 = (A28010 )/ A11cm,280nm (mg/ml)(Q 1%濃度10mg/ml)280nm 和260nm 的吸取差法280nm 處的吸取比蛋白質(zhì)強(qiáng)10 每克260nm 260nm 260nm 處的消光系數(shù)是280nm 處的2 倍，而蛋白質(zhì)則相反，280nm 紫外吸取值大于260nm 的吸取值。通常： A280/A260 0.5280含有核酸的蛋白質(zhì)溶液可分別測定其A280 和 A260，由此吸取差值用下面的閱歷公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度。 蛋白質(zhì)濃度=1.45A0.74280此閱歷公式是通過一系列不同濃度比例的蛋白質(zhì)酵母烯醇化酶和核酸酵母核酸 的混合液所測定的數(shù)據(jù)來建立的。215nm 與225nm 的吸取差法蛋白質(zhì)的稀溶液由于含量低而不能使用280nm 215nm 與225nm 吸收值之差，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法來測定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。用濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，配制成20100 mg/ml 的一系列5.0ml 的蛋白質(zhì)溶液，分別測定215nm和225nm D= A215 A225以吸取差D 為上查出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。20100mg/ml NaCSO4 24以及0.1M Tris 0.1N NaOH, 0.1M 乙酸、215nm 0.005M 以下才無顯