2022細(xì)菌外膜囊泡腫瘤疫苗對(duì)胰腺癌小鼠腫瘤細(xì)胞增殖和CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)的影響(全文)

1、2022 細(xì)菌外膜囊泡腫瘤疫苗對(duì)胰腺癌小鼠腫瘤細(xì)胞增殖和 CD8+ T 細(xì)胞浸潤(rùn)的影響（全文）摘 要目的 探討細(xì)菌外膜囊泡（OMVs）腫瘤疫苗對(duì)胰腺癌小鼠腫瘤細(xì)胞增殖和 CD8+ T 細(xì)胞浸潤(rùn)的影響。方法 采用實(shí)驗(yàn)研究方法。采用卵清蛋白（OVA）慢病毒載體質(zhì)粒 pLVEF1ahluc-P2A-mNeongreenCMVOVA 3XflagP2Apuro 構(gòu)建小鼠胰腺癌 Pan02OVA 細(xì)胞；采用大腸桿菌來(lái)源ClyA-Catchers-OMVs（CCOMVs）與標(biāo)簽化抗原肽 SpyTagOVA 制備OMVs 腫瘤疫苗；應(yīng)用 OMVs 腫瘤疫苗刺激小鼠 CD8+ T 細(xì)胞生成，采用體外細(xì)胞殺傷實(shí)

2、驗(yàn)（OMVs 腫瘤疫苗刺激 T 細(xì)胞組和對(duì)照 T 細(xì)胞組）、小鼠皮下胰腺癌成瘤模型（OMVs 腫瘤疫苗組和對(duì)照組）和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)分析 OMVs 腫瘤疫苗抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，刺激 CD8 T 細(xì)胞浸潤(rùn)的效果。觀察指標(biāo)：（1）小鼠胰腺癌 Pan02OVA 細(xì)胞鑒定情況。（2） CCOMVs 形態(tài)觀察情況。（3）OMVs 腫瘤疫苗特異性 T 細(xì)胞對(duì)小鼠胰腺癌 Pan02OVA 細(xì)胞增殖抑制情況。（4）OMVs 腫瘤疫苗對(duì)小鼠胰腺癌的抑制情況。（5）OMVs 腫瘤疫苗刺激小鼠胰腺癌組織 CD8 T 細(xì)胞浸潤(rùn)情況。正態(tài)分布的計(jì)量資料以 xs 表示，組間比較采用 t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以絕對(duì)數(shù)或百分率

3、表示。結(jié)果 （1）小鼠胰腺癌 Pan02OVA 細(xì)胞鑒定情況。激光共聚焦檢測(cè)結(jié)果顯示：感染 OVA 慢病毒載體質(zhì)粒 pLVEF1ahluc P2A mNeongreen CMV OVA 3Xflag P2A puro 的小鼠胰腺癌Pan02-OVA 細(xì)胞表達(dá) mNeongreen 綠色熒光。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示：以小鼠胰腺癌 Pan02 細(xì)胞為參照，Pan02OVA 細(xì)胞 Flag 蛋白表達(dá)率為90.7%。（2）CCOMVs 形態(tài)觀察情況。透射電子顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示：CCOMVs 呈均勻球形，直徑50 nm。（3）OMVs 腫瘤疫苗特異性 T 細(xì)胞對(duì)小鼠胰腺癌 Pan02-OVA 細(xì)胞增殖抑制

4、情況。細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)結(jié)果顯示：OMVs 腫瘤疫苗刺激T 細(xì)胞組小鼠胰腺癌Pan02OVA 細(xì)胞450 nm吸光度為 0.410.12，對(duì)照 T 細(xì)胞組為 1.050.15，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.54，P0.05）。（4）OMVs 腫瘤疫苗對(duì)小鼠胰腺癌的抑制情況。OMVs 腫瘤疫苗組小鼠背部皮下腫瘤組織質(zhì)量為（8110）g，對(duì)照組為（15317）g，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.26，P0.05）。（5）OMVs 腫瘤疫苗刺激小鼠胰腺癌組織 CD8 T 細(xì)胞浸潤(rùn)情況。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果顯示：OMVs 腫瘤疫苗組小鼠背部皮下腫瘤組織中 CD8 T 細(xì)胞染色數(shù)目為（28.

5、73.5）個(gè)，對(duì)照組為（9.31.5）個(gè)，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.74，P0.05）。結(jié)論 細(xì)菌 OMVs 腫瘤疫苗可抑制胰腺癌小鼠腫瘤細(xì)胞增殖并提高腫瘤組織中 CD8 T 細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目。關(guān) 鍵 詞胰腺腫瘤； 細(xì)菌外膜囊泡； 腫瘤疫苗； 免疫治療；動(dòng)物模型； 治療效果胰腺癌是一種高度惡性的消化系統(tǒng)腫瘤，手術(shù)切除率低，化療等治療效果有限，患者預(yù)后差，5 年生存率僅 10%。近年來(lái)，腫瘤免疫治療，特別是免疫檢查點(diǎn)抑制劑等發(fā)展迅速，在多種腫瘤治療中取得較好效果511。但免疫檢查點(diǎn)抑制劑單藥治療或聯(lián)合化療均未能有效延長(zhǎng)胰腺癌患者生存時(shí)間1213。主要原因是胰腺癌為“冷腫瘤”，其腫瘤組織內(nèi)浸

6、潤(rùn)的腫瘤特異性 T 細(xì)胞數(shù)量不足1213。筆者團(tuán)隊(duì)前期工作構(gòu)建基于細(xì)菌外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）的腫瘤疫苗制備平臺(tái)，可高效激活抗原特異性免疫反應(yīng)，刺激腫瘤特異性 T 細(xì)胞產(chǎn)生14。本研究通過(guò)制備小鼠胰腺癌 Pan02-OVA 細(xì)胞、構(gòu)建小鼠皮下胰腺癌成瘤模型，探討細(xì)菌 OMVs 腫瘤疫苗對(duì)胰腺癌小鼠腫瘤細(xì)胞增殖和 CD8+ T 細(xì)胞浸潤(rùn)的影響。材料與方法一、實(shí)驗(yàn)材料與方法采用實(shí)驗(yàn)研究方法。（一）實(shí)驗(yàn)材料1.小鼠胰腺癌 Pan02 細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；293T 細(xì)胞獲取自中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所。2.可穩(wěn)定表達(dá) ClyACat

7、chers 標(biāo)記 OMVs（CC-OMVs）的大腸桿菌由筆者團(tuán)隊(duì)構(gòu)建14。3.卵清蛋白（ovalbumin，OVA）慢病毒載體質(zhì)粒 pLVEF1ahlucP2AmNeongreenCMVOVA3XflagP2Apuro 由北京合生生物科技有限公司構(gòu)建；包裝質(zhì)粒 psPAX2、pMD2G 獲取自中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所。4.主要實(shí)驗(yàn)試劑：胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；病毒轉(zhuǎn)染試劑聚凝胺購(gòu)自北京蘭博利德商貿(mào)有限公司；嘌呤霉素、4，6二脒基2苯基吲哚（4，6diamidino2phenylindole，DAPI）購(gòu)自北京

8、索萊寶科技有限公司；4%多聚甲醛購(gòu)自北京蘭杰柯科技有限公司；PE 標(biāo)記大鼠抗小鼠 Flag 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)加州 BioLegend 公司；Bicinchoninic acid（BCA）蛋白定量試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；醋酸雙氧鈾購(gòu)自北京中鏡科儀技術(shù)有限公司；標(biāo)簽化抗原肽 SpyTagOVA 購(gòu)自上海強(qiáng)耀生物科技有限公司；RBC 裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)（cell counting kit8，CCK8）試劑盒購(gòu)自日本九州島同仁化學(xué)研究所；基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)紐約州康寧公司；兔抗小鼠 CD8 單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)劍橋 Abcam 公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊

9、抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)馬薩諸塞州SeraCare 公司；二氨基聯(lián)苯胺（diamnobenzidine，DAB）染色試劑盒購(gòu)自江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司。5.主要實(shí)驗(yàn)器材：共聚焦培養(yǎng)皿購(gòu)自康寧（美國(guó)）公司；電鏡銅網(wǎng)購(gòu)自北京中鏡科儀技術(shù)有限公司；超速離心管購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；孔徑分別為 0.45 m 和 0.22 m 的濾器購(gòu)自美國(guó)密理博公司；孔徑為 70 m 細(xì)胞篩網(wǎng)購(gòu)自韓國(guó)京畿道 SPL Lifesciences 公司。6.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：68 周齡雌性 C57BL/6 小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。本研究符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和研究的相關(guān)倫理規(guī)范，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)國(guó)家納米科學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫

10、理委員會(huì)審批，批號(hào)為 NCNST212101YC01。7.主要實(shí)驗(yàn)儀器：激光共聚焦掃描顯微鏡為德國(guó)蔡司公司 LSM700 產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀為安捷倫科技中國(guó)有限公司 NovoCyte 產(chǎn)品；超速離心機(jī)為美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司 Optima L100XP 產(chǎn)品；透射電子顯微鏡為日本電子株式會(huì)社 JEM1400 產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為美國(guó)佛蒙特州博騰儀器有限公司SILFA 產(chǎn)品。（二）實(shí)驗(yàn)方法1.細(xì)胞培養(yǎng)：小鼠胰腺癌 Pan02 細(xì)胞、293T 細(xì)胞采用含 10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基，添加100 U/mL 青霉素和100 g/L 鏈霉素，置于37 、 5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.OVA 慢病毒

11、制備、收集：OVA 慢病毒載體質(zhì)粒 pLVEF1ahlucP2AmNeongreenCMVOVA3XflagP2Apuro、包裝質(zhì)粒 psPAX2、包裝質(zhì)粒 pMD2G 按 431 體積比例混合后，采用 Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑，按說(shuō)明書感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 293T 細(xì)胞；36 h 后收集培養(yǎng)上清液，經(jīng) 0.45 m 孔徑濾器過(guò)濾獲得 OVA 慢病毒。3.小鼠胰腺癌 Pan02OVA 細(xì)胞的制備：OVA 慢病毒、聚凝胺按 1 0001 體積比例混合后，感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期小鼠胰腺癌 Pan02 細(xì)胞；36 h 后采用含 2 g/mL 嘌呤霉素、10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基篩選

12、小鼠胰腺癌 Pan02OVA 細(xì)胞，經(jīng)連續(xù) 3 次傳代培養(yǎng)獲得小鼠胰腺癌 Pan02OVA 細(xì)胞。4.小鼠胰腺癌 Pan02OVA 細(xì)胞的鑒定：（1）激光共聚焦檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期小鼠胰腺癌 Pan02OVA 細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿，24 h 后去除培養(yǎng)基，采用 4 PBS 漂洗細(xì)胞 3 次，采用 4%多聚甲醛固定細(xì)胞，采用 DAPI 染色細(xì)胞核，采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察細(xì)胞熒光。（2）流式細(xì)胞檢測(cè)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期小鼠胰腺癌 Pan02 細(xì)胞和 Pan02-OVA 細(xì)胞，采用 4 PBS 分別漂洗細(xì)胞 3 次，PE 標(biāo)記大鼠抗小鼠 Flag 單克隆抗體按 1100 稀釋后于 4 下避光孵育細(xì)

13、胞 30 min，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠胰腺癌 Pan02 細(xì)胞和 Pan02OVA 細(xì)胞 Flag 表達(dá)。5.CCOMVs 的制備：參照文獻(xiàn)14。收集可穩(wěn)定表達(dá) CCOMVs 的大腸桿菌培養(yǎng)基，于 4 條件下，5 000 r/min（離心半徑為 14.275 cm），離心 10 min；收集上清液分別經(jīng) 0.45 m 和 0.22 m 孔徑濾器過(guò)濾；收集濾液于 4 條件下，150 000 g 離心 3 h；收集沉淀物用無(wú)菌 PBS 充分溶解，并采用 BCA 蛋白定量試劑盒，按照說(shuō)明書檢測(cè) CCOMVs 溶液的濃度。6.CCOMVs 的形態(tài)觀察：取 CCOMVs 溶液 10 L 滴加在電鏡銅網(wǎng)上

14、，室溫下靜置 15 min 后輕甩電鏡銅網(wǎng)棄去溶液，滴加 10 L 醋酸雙氧鈾在電鏡銅網(wǎng)上，室溫下靜置 15 min 后輕甩電鏡銅網(wǎng)棄去溶液，于陰涼干燥處?kù)o置電鏡銅網(wǎng) 12 h，采用透射電子顯微鏡檢測(cè) CCOMVs 形態(tài)。7.OMVs 腫瘤疫苗的制備：參照文獻(xiàn)14。分別取 50 g CCOMVs 和g SpyTagOVA 于室溫下混合獲得 OMVs 腫瘤疫苗。8.小鼠 T 細(xì)胞的制備：取 68 周齡雌性 C57BL/6 小鼠，分為 OMVs 腫瘤疫苗組和 PBS 對(duì)照組，每組 3 只；分別于第 0、3 天通過(guò)腹部皮下注射 100 L OMVs 腫瘤疫苗或100 L PBS；于第10 天采用脊髓

15、脫臼法處死小鼠，取脾臟研磨后采用 70 m 孔徑細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾；收集過(guò)濾液按 15 體積比例加入 RBC 裂解液，混勻后室溫下靜置 2 min；4 條件下，500 g 離心min；收集沉淀物用無(wú)菌 PBS 充分重懸，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用。9.細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期小鼠胰腺癌 Pan02OVA 細(xì)胞接種于 96 孔板，分為 OMVs 腫瘤疫苗刺激 T 細(xì)胞組和對(duì)照 T 細(xì)胞組，每組 8 孔，每孔接種 5 000 個(gè)細(xì)胞；接種 12 h 后，OMVs 腫瘤疫苗刺激 T 細(xì)胞組、對(duì)照 T 細(xì)胞組每孔分別加入 20 000 個(gè)上述實(shí)驗(yàn) 8 中 OMVs 腫瘤疫苗組小鼠 T 細(xì)胞或 PBS 對(duì)照組小鼠 T

16、 細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，按照 CCK8 試劑盒操作步驟，采用酶標(biāo)儀檢測(cè) 450 nm 吸光度。10.OMVs 腫瘤疫苗小鼠胰腺癌抑制實(shí)驗(yàn)：取 68 周齡雌性 C57BL/6 小鼠，分為 OMVs 腫瘤疫苗組和對(duì)照組，每組 5 只；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期小鼠胰腺癌 Pan02OVA 細(xì)胞，與基質(zhì)膠等體積混合制成細(xì)胞濃度為 1107 個(gè)/mL 細(xì)胞懸液；采用 1 mL 胰島素注射針吸取 100 L 細(xì)胞懸液接種于 OMVs 腫瘤疫苗組和對(duì)照組小鼠背部皮下；OMVs 腫瘤疫苗組于細(xì)胞接種后第 5、9、13 天通過(guò)小鼠腹部皮下注射 100 L OMVs 腫瘤疫苗。對(duì)照組于同一時(shí)間點(diǎn)同一位置注射 100

17、L PBS；于細(xì)胞接種后第 20 天采用脊髓脫臼法處死小鼠，收集小鼠背部皮下腫瘤組織并拍照、稱重。11.免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)：采用 DAB 染色方法，操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書，兔抗小鼠單克隆 CD8 抗體按 12 000 稀釋，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗按 1200 稀釋。由 2 位獨(dú)立的病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片，評(píng)估染色結(jié)果。二、觀察指標(biāo)（1）小鼠胰腺癌 Pan02OVA 細(xì)胞鑒定情況：激光共聚焦檢測(cè)結(jié)果和流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果。（2）CCOMVs 形態(tài)觀察情況：透射電子顯微鏡檢測(cè)結(jié)果。（3）OMVs 腫瘤免疫特異性 T 細(xì)胞對(duì)小鼠胰腺癌 Pan02-OVA 細(xì)胞增殖抑制情況：CCK8 檢測(cè)結(jié)果

18、。（4）OMVs 腫瘤疫苗對(duì)小鼠胰腺癌的抑制情況：小鼠背部皮下腫瘤組織質(zhì)量。（5）OMVs 腫瘤疫苗刺激小鼠胰腺癌組織 CD8+ T 細(xì)胞浸潤(rùn)情況：小鼠背部皮下腫瘤組織中 CD8+ T 細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用 SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以 xs 表示，組間比較采用 t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以絕對(duì)數(shù)或百分率表示。P0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果一、小鼠胰腺癌 Pan02OVA 細(xì)胞鑒定情況激光共聚焦檢測(cè)結(jié)果顯示：感染 OVA 慢病毒載體質(zhì)粒 pLVEF1a hluc-P2AmNeongreen-CMV-OVA-3Xflag-P2Apuro 的小鼠

19、胰腺癌Pan02OVA 細(xì)胞表達(dá) mNeongreen 綠色熒光。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示：以小鼠胰腺癌 Pan02 細(xì)胞為參照，Pan02OVA細(xì)胞 Flag 蛋白表達(dá)率為 90.7%。二、CC-OMVs 形態(tài)觀察情況透射電子顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示：CCOMVs 呈均勻球形，直徑50 nm。三、OMVs 腫瘤疫苗特異性 T 細(xì)胞對(duì)小鼠胰腺癌 Pan02OVA 細(xì)胞增殖抑制情況CCK8 檢測(cè)結(jié)果顯示：OMVs 腫瘤疫苗刺激 T 細(xì)胞組小鼠胰腺癌 Pan02OVA 細(xì)胞 450 nm 吸光度為 0.410.12，對(duì)照 T 細(xì)胞組為 1.050.15，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.54，P0.001）。四、OMVs 腫瘤疫苗對(duì)小鼠胰腺癌的抑制情況OMVs 腫瘤疫苗組小鼠背部皮下腫瘤組織質(zhì)量為（8110）g，對(duì)照組為（15317）g，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.26，P0.001）。五、OMVs 腫瘤疫苗刺激小鼠胰腺癌組織 CD8+ T 細(xì)胞浸潤(rùn)情況免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果顯示：OMVs 腫瘤疫苗組小鼠背部皮下腫瘤組織中 CD8+ T 細(xì)胞染色數(shù)目為（28.73.5）個(gè)，對(duì)照組為（9.31.5）個(gè)，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.74，P0.001）。討論已有的研究結(jié)果顯示：腫瘤疫苗可以刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生腫瘤特異性 T 細(xì)胞，發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用151