羊水細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在產(chǎn)前診斷的應(yīng)用

1、羊水細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在產(chǎn)前診斷的應(yīng)用摘要目的：利用羊水細(xì)胞培養(yǎng)方法，胎兒染色體核型分析進(jìn)展染色體病的產(chǎn)前診斷。方法：采用羊水細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，建立收獲標(biāo)準(zhǔn)及改進(jìn)收獲方法,對(duì)270例孕婦胎兒進(jìn)展了羊水穿刺術(shù)及羊水細(xì)胞培養(yǎng)。結(jié)果:羊水培養(yǎng)成功率為96.30%,縮短了培養(yǎng)時(shí)間(9d10d)。結(jié)論:羊水細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)成功率高、培養(yǎng)時(shí)間短、可分析核型多,便于臨床開(kāi)展。關(guān)鍵詞羊水;細(xì)胞培養(yǎng);產(chǎn)前診斷羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制備是染色體病產(chǎn)前診斷的主要手段。由于羊水細(xì)胞培養(yǎng)一直存在技術(shù)要求高、難度大、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、易污染、分裂相較少等問(wèn)題,許多單位仍未能開(kāi)展羊水產(chǎn)前診斷工作。近10年來(lái),世界各地對(duì)羊水細(xì)胞的培養(yǎng)及其在

2、染色體制片上雖不斷有所改進(jìn),但羊水細(xì)胞培養(yǎng)與制片仍有一定難度。近3年來(lái),我們對(duì)羊水細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)展了探究和改進(jìn),并進(jìn)展了270例羊水染色體的制備,效果滿(mǎn)意,現(xiàn)報(bào)告如下。1資料與方法1.1病例來(lái)源200例為陜西省婦幼保健院遺傳優(yōu)生及產(chǎn)前診斷門(mén)診中有產(chǎn)前診斷指征的患者，70例為外院送檢患者。1.2方法1.2.1羊水采集在孕17周23周進(jìn)展穿刺。常規(guī)消毒,B超引導(dǎo)下采用22號(hào)穿刺針穿刺,最初抽取的1l2l羊水棄去,換另一注射器抽取羊水20l30l,注入無(wú)菌離心管中送檢。羊水中少量紅細(xì)胞不需處理,如有明顯血性羊水,立即在羊水中參加無(wú)菌肝素1滴，標(biāo)本盡快送實(shí)驗(yàn)室接種。1.2.2羊水細(xì)胞培養(yǎng)將羊水以120

3、0r/in1500r/in離心10in,棄去上清液,保存0.5l羊水細(xì)胞層,以滴管打勻,接種于1252培養(yǎng)瓶(鼎國(guó)公司提供),并參加羊水培養(yǎng)液3lAniax混勻,置于5%2培養(yǎng)箱中半開(kāi)放式培養(yǎng)。第5天開(kāi)場(chǎng)觀察，假設(shè)觀察到有較好的梭形細(xì)胞克隆那么更換培養(yǎng)液。用一次性滴管吸干原來(lái)的培養(yǎng)液后,參加新穎培養(yǎng)液4l。于收獲前1天或收獲當(dāng)天再換液1次。收獲時(shí)在培養(yǎng)終止前3h參加秋水仙素,最終濃度為25g/l。1.2.3羊水細(xì)胞收獲收獲細(xì)胞時(shí),根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛程度采取收獲方法。在細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)量少時(shí)，采用原位法。將培養(yǎng)液倒出，參加0.6%的檸檬酸鈉10l于培養(yǎng)瓶中37.0，低滲40in，棄液，用31甲醇冰醋酸

4、固定液固定2次后，敲開(kāi)培養(yǎng)瓶，獲取培養(yǎng)瓶細(xì)胞生長(zhǎng)面塑料片1張2張，55烤片過(guò)夜。在細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)量多時(shí)，用吸管將細(xì)胞吹打后倒入離心管中,在每個(gè)離心管內(nèi)參加8l已預(yù)溫至37的0.6%枸櫞酸鈉低滲液,每管低滲10in,用31甲醇冰醋酸固定液固定后，滴片1張2張,55烤片過(guò)夜。胰酶法G顯帶。按照人類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISN1995)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)展核型分析診斷。2結(jié)果2.1成功率270例標(biāo)本中,成功260例,一次性培養(yǎng)成功率到達(dá)96.30%。2.2培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)收獲時(shí)間大多數(shù)為9d10d,最早收獲在第7天,最長(zhǎng)14d。2.3核型效果每例羊水培養(yǎng)可獲得1張2張染色體玻片或培養(yǎng)瓶塑料片,每片可獲10個(gè)20個(gè)分

5、散較好的分裂相。3討論3.1羊水培養(yǎng)首先必須有好的培養(yǎng)基傳統(tǒng)的培養(yǎng)基是在F10中參加一定比例的胎牛血清,由于營(yíng)養(yǎng)成份較少,羊水細(xì)胞培養(yǎng)所需時(shí)間較長(zhǎng),培養(yǎng)成功率低。國(guó)內(nèi)有些學(xué)者通過(guò)添加生長(zhǎng)因子或用血清代用品1來(lái)培養(yǎng)羊水,但步驟繁瑣,也容易造成污染。我們采用Aniax培養(yǎng)基,因其營(yíng)養(yǎng)成份較齊全,省去了添加生長(zhǎng)因子等步驟,方便省時(shí)、收效率高。本實(shí)驗(yàn)270例羊水細(xì)胞均生長(zhǎng)良好,形成的圓形、雙圓形細(xì)胞較多。一次性培養(yǎng)成功260例,成功率為96.30%,比文獻(xiàn)報(bào)道的91.6%2及92.08%3略高,可能與培養(yǎng)基的改進(jìn)、孕周的選擇以及病例數(shù)相對(duì)較少有關(guān)。3.2建立收獲標(biāo)準(zhǔn)要收獲較多的分裂相,必須在適當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)

6、收獲。我們于10倍目鏡和10倍物鏡下觀察:以梭長(zhǎng)形羊水細(xì)胞(AF細(xì)胞)為主要類(lèi)型的生長(zhǎng)細(xì)胞,形成的細(xì)胞克隆覆蓋1個(gè)或1個(gè)以上的完好視野；培養(yǎng)瓶中有2個(gè)3個(gè)以上細(xì)胞克隆,且每個(gè)細(xì)胞克隆中存在有20個(gè)以上的圓形、雙圓形或葡萄狀透亮細(xì)胞；細(xì)胞克隆中央的細(xì)胞開(kāi)場(chǎng)老化,克隆周邊細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛。3.3改進(jìn)收獲方法我們根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)密集程度，采用原位法或改用特殊玻璃長(zhǎng)彎吸管吹打搜集細(xì)胞，兩種方法結(jié)合使用，進(jìn)步了實(shí)驗(yàn)的成功率。3.4血性羊水處理羊水有嚴(yán)重的血細(xì)胞污染時(shí),立即在羊水中參加無(wú)菌肝素1滴,盡快離心接種,防止紅細(xì)胞凝集時(shí)把羊水細(xì)胞也凝集起來(lái)4,并采取提早換液及屢次換液的方法,同樣也可獲得成功。本組2例嚴(yán)重的血性羊水,用該方法培養(yǎng)獲得成功。3.5關(guān)于抗生素的應(yīng)用由于抗生素在抗菌的同時(shí)也抑制了羊水細(xì)胞的生長(zhǎng),故主張盡量不用或少用。如疑心羊水受細(xì)菌、霉菌或支原體污染時(shí),應(yīng)考慮使用，用量一般與組織培養(yǎng)一樣。我們?cè)?例羊水培養(yǎng)時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)良好,與一般的培養(yǎng)無(wú)異,但換液后發(fā)現(xiàn)有污染跡象,羊水細(xì)胞的正常構(gòu)造也遭到破壞,疑為支原體污染，及時(shí)添加了抗生素,終于收到滿(mǎn)意的分裂相。參考文獻(xiàn)：1丁顯平.血清代用品在羊水細(xì)胞培養(yǎng)染色體分析中的應(yīng)用J.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志,2002,19(2):1802.2馮懷英,朱寶生,孟昱時(shí),等.妊娠中晚期羊水細(xì)胞胎兒染色體異常核型分析J.中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志,20