熒光原位雜交和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合FISH―FCM對(duì)肉食品中腸桿菌科細(xì)菌的快速定量檢測(cè)

1、熒光原位雜交和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合 FISHFCM對(duì)肉食品 中腸桿菌科細(xì)菌的快速定量檢測(cè)腸桿菌科 (Enterobacteriaceae )細(xì)菌是一類分布極為廣泛 的革蘭氏陰性菌，包括對(duì)人致病性較強(qiáng)的埃希菌屬、志賀菌屬、 沙門(mén)菌屬、耶爾森菌屬細(xì)菌 1 。腸桿菌作為歐盟各國(guó)食品衛(wèi)生 檢查中重要的指標(biāo)細(xì)菌，是國(guó)際間食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控 制、水平測(cè)試的必測(cè)項(xiàng)目之一。目前，我國(guó)仍以大腸菌群、糞大 腸菌群作為食品衛(wèi)生指標(biāo)菌。 以腸桿科菌替代大腸菌群、 糞大腸 菌群作為檢測(cè)指標(biāo)可消除因后者產(chǎn)氣特性隨檢驗(yàn)方法、 試驗(yàn)條件 不同而造成結(jié)果的不準(zhǔn)確性 2 。由于我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)管理不當(dāng)， 出口畜禽產(chǎn)品中腸桿菌科細(xì)菌

2、檢測(cè)超標(biāo)現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生， 易被歐盟 發(fā)達(dá)國(guó)家市場(chǎng)拒絕， 進(jìn)而形成所謂的貿(mào)易壁壘。 我國(guó)進(jìn)出口商檢 局經(jīng)過(guò)多次修訂， 制定了針對(duì)畜禽等農(nóng)產(chǎn)品中腸桿菌檢測(cè)的行業(yè) 標(biāo)準(zhǔn)SN/T 07381997出口食品中腸桿菌科檢驗(yàn)方法。該標(biāo) 準(zhǔn)以傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法為基礎(chǔ)，包括分離培養(yǎng)、生化判定，其 步驟繁瑣，時(shí)間冗長(zhǎng)，工作量大，得到報(bào)告結(jié)果通常需要3 d 左右。過(guò)長(zhǎng)的檢驗(yàn)時(shí)間使得生產(chǎn)部門(mén)延誤時(shí)間，增加成本，造成一 定的經(jīng)濟(jì)損失，而且無(wú)法應(yīng)對(duì)緊急情況。因此，各級(jí)食品衛(wèi)生防 疫部門(mén)迫切需要一種快速準(zhǔn)確定量檢測(cè)腸桿菌的方法。 本研究通 過(guò)利用熒光原位雜交與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合 (FISH-FCM對(duì)畜禽肉 產(chǎn)品中腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)

3、行定量檢測(cè)，并與傳統(tǒng)行標(biāo)方法進(jìn)行比 較，探討FISH-FCM在食品安全衛(wèi)生領(lǐng)域中應(yīng)用的可行性。材料與方法待檢樣品本試驗(yàn)檢測(cè)的 8 份豬肉樣品、 4 份雞肉鮮樣品分別隨機(jī)取自 江蘇省揚(yáng)州市 A B、C、D等4個(gè)不同的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。菌種 本試驗(yàn)中所采用的部分細(xì)菌（大腸桿菌、福氏志賀氏菌、宋氏志賀氏菌、 鼠傷寒沙門(mén)氏菌、 豬霍亂沙門(mén)氏菌、 普通變形桿菌、 枯草芽孢桿菌、 地衣芽孢桿菌） 由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所唐 夢(mèng)君老師、龔建森老師提供。寡核苷酸探針根據(jù) Sghir 等報(bào)道 3 ，試驗(yàn)采用腸桿科細(xì)菌特異性探針Enter1432，序列為 5 -CTTTTGCAACCCACT-。其中 5 端由異 硫氰酸

4、酯熒光素FITC （Abs/Em=494/520）標(biāo)記，由寶生物工程（大連）XX公司合成并標(biāo)記探針。FISH-FCM 法驗(yàn)證探針的特異性將大腸桿菌、福氏志賀氏菌、宋氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏 菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢 桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌、屎腸球菌 11 種菌株按 照常規(guī)劃線培養(yǎng)法獲得單菌落， 在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 將細(xì)菌濃 度調(diào)整為0.1億個(gè)/mL,雜交方法參照Vaahtovuo等的報(bào)道4-5 并有所改進(jìn)：（1）取200卩L菌液，用等體積8%多聚甲醛溶液于4 C固定1 h ;(2)固定完畢后，將樣品于 12 000 g高速離心10 min，用PBS

5、緩沖液洗滌3次；(3)取10卩L固定的菌 液，加入85卩L預(yù)熱的雜交緩沖液(0.9 mol/L NaCI, pH值7.2 的 20 mmol/L Tris-HCI , 0.1% SDS 中，加入 5 卩 L 100 ng/ 卩 L 探針，50 C雜交2 h ; ( 4) 在 1 mL PBS緩沖液中加入50 L 雜交溶液，渦旋振蕩；( 5)將溶液上流式細(xì)胞儀( BD FACSCaliburTM， Becton Dickinson ，美國(guó))，對(duì)每個(gè)樣品分析000 個(gè)物體。FISH-FCM 法檢測(cè)樣品鮮肉樣品前處理步驟同 SN/T 07381997出口食品中腸桿 菌科檢驗(yàn)方法，制備成稀釋 10倍的

6、肉樣液。取1 mL肉樣液， 80 g低速離心1 min,去除雜質(zhì)。其余雜交方法同上，制備“1.4 ” 節(jié)步驟(5)中的液體，加入10卩L 0.5 mg/mL碘化丙啶，37 C 避光孵育20 min。加入50卩L 1 000個(gè)/卩L熒光微球( CountBringhtTM , Invitrogeon ,美國(guó))?；旌先芤荷蠘佑诹?式細(xì)胞儀分析,每個(gè)樣品分析 10 000 個(gè)物體。培養(yǎng)法檢測(cè)樣品按照 SN/T 07381997出口食品中腸桿菌科檢驗(yàn)方法中 相應(yīng)方法檢測(cè)樣品。試驗(yàn)方法用 CellQuest Pro 軟件(版本 5.2.1 , Becton Dickinson , 美國(guó))分析。在 dot

7、 plot 圖上, x 軸表示雜交結(jié)合熒光探針的目的細(xì)菌的熒光強(qiáng)度，y軸表示DNA染料的熒光強(qiáng)度。按照以下 公式計(jì)算肉樣品中的細(xì)菌數(shù)量：ABX CD 104=測(cè)定樣本的細(xì)菌濃度。式中：A為目的細(xì)菌所占比例，% B為熒光微球所占比例，% C為測(cè)定樣本中的熒光的數(shù)量，個(gè)；D為測(cè)定樣本的體積或質(zhì)量，g/ 卩 L。2 結(jié)果與分析FISH-FCM 法驗(yàn)證探針 Enter1432 的有效性由圖1-A 可知，目標(biāo)菌株幾乎未與探針 Enter1432 結(jié)合，在 dot plot 散點(diǎn)圖上處于Q4區(qū)域，呈陰性結(jié)果；由圖1-B可知，目標(biāo)菌株 大部分與探針Enter1432結(jié)合，在dot plot散點(diǎn)圖上處于Q3區(qū)

8、 域，呈陽(yáng)性結(jié)果。 由表 1 可知， 6 種腸桿科細(xì)菌與探針 Enter1432 的雜交率為91.9%95.7%,而5種非腸桿科細(xì)菌與探針的雜交 率均低于 1%。FISH-FCM 法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較檢測(cè)肉樣品中的腸桿科 細(xì)菌由圖2、表2可知，按照 SN/T 07381997出口食品中腸 桿菌科檢驗(yàn)方法 傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測(cè) 8 份豬肉樣品中腸桿科細(xì)菌 數(shù)量為 0.63 萬(wàn)53萬(wàn) CFU/g， 4份雞肉樣品中腸桿科細(xì)菌數(shù)量 為0.10萬(wàn)1.5萬(wàn)CFU/g。用FISH-FCM法檢測(cè)8份豬肉樣品中 腸桿科細(xì)菌數(shù)量為1.4萬(wàn)640萬(wàn)個(gè)/g , 4份雞肉樣品中腸桿科 細(xì)菌數(shù)量為5.0萬(wàn)21萬(wàn)個(gè)/g 。結(jié)論與

9、討論熒光原位雜交（FISH）法鑒定微生物最初應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域 6-8 ，熒光素標(biāo)記的核酸探針可與目的細(xì)菌結(jié)合，使其在熒光 顯微鏡下顯示出相應(yīng)顏色，該方法具有特異性高、直觀的特點(diǎn)， 但是由于通常情況下為保證統(tǒng)計(jì)結(jié)果的準(zhǔn)確性， 操作人員需要選 擇多達(dá)數(shù) 10 個(gè)視野進(jìn)行分析，這無(wú)疑增加了工作量，降低了試 驗(yàn)效率。流式細(xì)胞術(shù)是一種能夠?qū)渭?xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行理 化、免疫及分子生物學(xué)等多參數(shù)性狀檢測(cè)的現(xiàn)代分析技術(shù)， 具有 速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)。已有研究將FISH與FCM相結(jié)合用于分析活性淤泥、海水樣品中目標(biāo)菌群的數(shù)量變化9-10。此外，近年來(lái)研究人員通過(guò) FISH-FCM法分析人體或動(dòng) 物排

10、出糞樣中有害菌、有益菌的數(shù)量變化，以監(jiān)測(cè)其健康11-12 。環(huán)境中的物質(zhì)及人或動(dòng)物的腸道內(nèi)容物十分復(fù)雜，不 僅含有大量細(xì)菌，還含有許多非細(xì)菌物質(zhì)，包括食物殘?jiān)?、有機(jī) 碎屑以及脫落細(xì)胞等。雖然目前FISH-FC M尚未被應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域的檢測(cè)， 但是該技術(shù)可應(yīng)用于上述如此復(fù)雜成分物質(zhì)的微 生物分析檢測(cè)， 筆者認(rèn)為對(duì)于食品而言， 該項(xiàng)技術(shù)應(yīng)該存在較強(qiáng) 的可行性，并具有廣闊的應(yīng)用前景。在本試驗(yàn)中 Enter1432 探針與 6 種腸桿科細(xì)菌雜交率均在 90%以上，而與非腸桿科細(xì)菌的雜交率均在1%以內(nèi)，說(shuō)明Enter1432 探針在鑒定腸桿科細(xì)菌上具有較高的特異性，這與前 人的研究結(jié)果 4， 13一

11、致。在檢測(cè)豬、雞鮮肉樣品中腸桿菌科細(xì)菌數(shù)量方面，經(jīng) SN/T 07381997出口食品中腸桿菌科檢驗(yàn) 方法法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)， 12 份樣品中均檢測(cè)到腸桿菌科細(xì)菌，檢出 率為100%且腸桿菌科細(xì)菌數(shù)量在 0.1萬(wàn)53萬(wàn)CFU/g之間， 不同樣品檢測(cè)結(jié)果差異較大。根據(jù)瑞士聯(lián)邦獸醫(yī)局 1981 年的標(biāo) 準(zhǔn)，生碎肉制品中腸桿科細(xì)菌含量的上限是500萬(wàn)CFU/g，而近年歐盟對(duì)豬胴體的腸桿科細(xì)菌作出了更加嚴(yán)格且上限為 3 lg CFU/cm2的規(guī)定，由此可見(jiàn)本試驗(yàn)中部分樣本腸桿菌科細(xì)菌污染 較為嚴(yán)重。 筆者推測(cè)， 由于本試驗(yàn)中所采集的鮮肉樣本均來(lái)自傳 統(tǒng)集市商販，肉品在經(jīng)過(guò)屠宰、加工、運(yùn)輸?shù)雀鱾€(gè)環(huán)節(jié)中均存在 污

12、染的可能。 由于歐盟對(duì)動(dòng)物屠宰過(guò)程的衛(wèi)生要求較高， 對(duì)其加 工過(guò)程控制進(jìn)行可追溯且肉品包裝后須急凍處理， 從而抑制細(xì)菌 繁殖，后期肉品多經(jīng)大型超市出售給消費(fèi)者， 而我國(guó)目前大多數(shù) 以攤販為主要特征的集市貿(mào)易手段在上述各個(gè)環(huán)節(jié)中對(duì)肉品的 衛(wèi)生控制程度不高， 細(xì)菌的繁殖滋生現(xiàn)象可能較為明顯， 因此本 試驗(yàn)采集的肉樣品存在較高的腸桿菌科細(xì)菌檢出率、檢出數(shù)量。本試驗(yàn)采用FISH-FCM法檢測(cè)肉樣品中的腸桿科細(xì)菌數(shù)量值 是 SN/T 07381997出口食品中腸桿菌科檢驗(yàn)方法中相應(yīng)檢 測(cè)法的 8.1 20.7 倍。由于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法只針對(duì)活的目標(biāo)細(xì)菌， 對(duì)于已死亡或者弱活力細(xì)菌在培養(yǎng)操作過(guò)程中無(wú)法檢測(cè)出，而 FISH-FCM法針對(duì)目標(biāo)細(xì)菌的DNA進(jìn)