膠體金標(biāo)記蛋白A技術(shù)(ProteinA-goldtechnique,PAg法)課件

1、關(guān)鍵詞：膠體蛋白標(biāo)記膠體金標(biāo)記蛋白 A 技術(shù) ProteinA-goldtechniquePAg 法膠體金 PAg 復(fù)合物制備方法簡便，作為第二抗體，無種屬特異性，可以免去不同種屬動物要制備不同的特異性免疫球蛋白。PAg 復(fù)合物與包埋劑和細胞成分都極少發(fā)生非特異性的交互作用，蛋白 A 和金粒間非共價的結(jié)合特性既不影響蛋白 A 的活性，又能保持高度的穩(wěn)定性，PAg 復(fù)合物分子最小易于穿透組織。PAg 復(fù)合物的原液在 4可保存達一年之久。電鏡水平的 PAg 染色法 PAg 法在電鏡技術(shù)的應(yīng)用原則是二步標(biāo)記法，可用于包埋前和包埋后染色。其主要區(qū)別于一般膠體金免疫染色在：須 1% 卵 白 蛋 白 PB

2、s 或 1% 卵 白 蛋 白0.05mol/lTris 緩沖液來封閉非特異性的結(jié)合部位，而不是采用羊或其它的動物的正?？寡澹驗?PAg 復(fù)合物能夠與正常血清組中的 Ig 結(jié)合，從而給出假陽性結(jié)果；在應(yīng)用第一抗血清孵育和 PBS 沖洗后作第二抗血清即 PAg 復(fù)合物孵育前的準備時，應(yīng)用的 PBS 或 TBS 的 pH 應(yīng)變更為pH8.2。其它可參照本節(jié)中包埋后染色法進行。液體配制：那本書被木子用得很小心。袁慕野畢業(yè)要走的時候，木子去買了一塊德芙巧克1、膠體金稀釋液配方：的 0.02mo1LTrisTBS 緩沖液，加入試劑級卵清白蛋白至 1。 免疫電鏡按 1：20-50 稀釋，淡紅色為適宜稀釋

3、液,膠體金稀釋后應(yīng)于當(dāng)天使用，未用完的應(yīng)該丟棄。2、清洗液：0.5molL，pH7.4Tris-Hcl 緩沖液：Tris，60.57g，1molLHcl 約 420m1，調(diào) pH 值至 7.4，最后加雙蒸水至 1000m1，此為儲備液。那本書被木子用得很小心。袁慕野畢業(yè)要走的時候，木子去買了一塊德芙巧克前封閉液：1%卵白蛋白 0.05mo1LTris 緩沖液；后封閉液以及膠體金稀釋液：1%卵白蛋白0.02mo1LTris 緩沖液，后封閉為膠體金結(jié)合作準備。具體操作:一、包埋：常規(guī)電鏡制樣，樣品只需要戊二醛固定，不需要鋨酸后固定。丙酮梯度脫水時 70的丙酮中沒有添加染色劑。樣品于 37 度烘箱中

4、固化。二、切片：超薄切片厚 5070nm 左右，載于 300 網(wǎng)孔的鎳網(wǎng)上?？乖迯?fù)：1、置 1%H2O2 內(nèi) 10min 至 1h，以去鋨酸和增進樹脂穿透性，有利抗體進入。如切片很薄或于低溫包埋時，此步可省略。操作時，滴入 1%H2O2液 1 滴于蠟板上，將網(wǎng)的載片面輕浮于液滴上。那本書被木子用得很小心。袁慕野畢業(yè)要走的時候，木子去買了一塊德芙巧克對中樞神經(jīng)系統(tǒng)切片，有主張以 1%過碘酸鉀代替H2O2 的。2、雙蒸水洗 3 次，每次 10min，第 1，2 次浮于液滴上清洗，第 3 次以盛雙蒸水的注射器沿鎳網(wǎng)面沖洗，水流應(yīng)有適當(dāng)壓力，但不宜過高強，用濾紙在網(wǎng)緣將水吸干。(0.05mo1LTB

5、SpH7.4洗 5min3 次?)三、封閉以及免疫反應(yīng)：1、載有超薄片的鎳網(wǎng)或金網(wǎng)浮于 1%卵白蛋白TBS 液滴上，室溫約 1h，阻斷非特異性吸附，吸去多余血清，不洗。2、載網(wǎng)直接移至第一抗血清液滴上(抗體稀釋度較常規(guī)免疫組化低 l 倍)，在室溫孵育 2h 或41824h。3、0.05mo1LTBSpH7.4，洗 5min3次。0.02mo1LTBSPH8.2，洗 5min3 次。1卵清白蛋白 0.02mo1LTBS37孵育 lh，再次阻斷非特異性吸附，吸去多余液體，不洗。4、將 PAg 原液稀釋 1020 倍，載網(wǎng)浮于該液滴上，室溫孵育 10min 至 1h?？贵w高度特異性和親和力以及被檢組

6、織內(nèi)抗原含量高；標(biāo)本的前處理和染色也至關(guān)重要。取消鋨酸后固定，聚合溫度不宜高于 45 度，可以選用 37 度 12 小時，45 度 48 小時作為聚合溫度。試驗全過程應(yīng)保持網(wǎng)面的濕潤。緩沖液要清潔，最好用新鮮配制的或經(jīng)微孔濾紙過濾后使用。染色前所用器皿必須清潔干凈且專用，并用雙蒸水沖洗三遍，染色程序中的洗滌必須充分，以減少背景染色。尤其雙重免疫標(biāo)記的切片染色window._bd_share_config=mon:bdSnsKey:,bdText:,bdMini:2,bdMiniList:false,bdPic:,bdStyle:0,bdSize:32,share:,image:viewList:copy,sqq,qzone,tsina,tqq,renren,weixin,viewText: 分 享 到 ：,viewSize:16,selectShare:bdContainerClass:null,bdSelectMiniList:cop