β-丙氨酸合成方法的研究進(jìn)展

1、-丙氨酸合成方法的研究進(jìn)展-丙氨酸(-alanine，C3H7NO2)，易溶于水，是自然界中唯一存在的型氨基酸。與組成人體蛋白質(zhì)20種氨基酸之一的-丙氨酸互為同分異構(gòu)體。-丙氨酸作為一種非蛋白氨基酸，可以在微生物、植物和昆蟲體內(nèi)合成，而哺乳動(dòng)物需從外界環(huán)境中攝取1-2。-丙氨酸廣泛被應(yīng)用在醫(yī)藥、食品、化工和環(huán)境等領(lǐng)域。首先，工業(yè)上很多重要化合物如：3-羥基丙酸(3-hydroxypropionic acid)、聚3-羥基丙酸酯(poly 3-hydroxypropionate)、泛酸(pantothenic acid)、肌肽(carnosine)、帕米膦酸鈉(pamidronate)和巴柳氮(

2、balasalazide)等是以-丙氨酸為重要前體或中間體合成的3-7。其次，在食品行業(yè)中，-丙氨酸既是一種食品添加劑改善食品味道，還被作為運(yùn)動(dòng)員營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，改善身體機(jī)能8-9。此外，它還可以直接用于生產(chǎn)聚-丙氨酸，廣泛應(yīng)用于化妝品、水凈化和建筑等領(lǐng)域10-11。近年來(lái)-丙氨酸系列產(chǎn)品的全球需求量約為5萬(wàn)t，且仍在不斷增加，預(yù)計(jì)到2023年全球市場(chǎng)需求可達(dá)8.1萬(wàn)t，被稱為未來(lái)全球12種最具開發(fā)潛力的三碳化工產(chǎn)品之一12。世界上-丙氨酸主要通過化學(xué)法、生物酶轉(zhuǎn)化法以及微生物發(fā)酵法進(jìn)行生產(chǎn)。其中反應(yīng)條件溫和，對(duì)環(huán)境友好的微生物發(fā)酵法受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注，目前已經(jīng)報(bào)道的最高產(chǎn)量為43.12 g/L

3、13。但是該水平還達(dá)不到工業(yè)化水平。值得注意的是，L-天冬氨酸-脫羧酶(L-asparatate-decarboxylase，EC4.1.1.11 PanD)是酶法與微生物發(fā)酵法合成-丙氨酸的關(guān)鍵，該酶通過催化一分子L-天冬氨酸脫去位羧基釋放一分子CO2，生成-丙氨酸，是影響-丙氨酸產(chǎn)量的關(guān)鍵。近年來(lái)對(duì)PanD的蛋白晶體結(jié)構(gòu)、酶學(xué)性質(zhì)以及催化機(jī)制也有了深入的研究，對(duì)其過表達(dá)和改造也是催化法提高-丙氨酸產(chǎn)量的關(guān)鍵。近年來(lái)，隨著-丙氨酸市場(chǎng)需求量逐年增加，對(duì)-丙氨酸產(chǎn)量方面的研究也越來(lái)越多。本文將通過對(duì)近幾年-丙氨酸的合成方法及過程、代謝工程、調(diào)控機(jī)制和關(guān)鍵酶的研究進(jìn)展進(jìn)行全面綜述，為-丙氨酸合成

4、產(chǎn)量的進(jìn)一步提高提供基礎(chǔ)。2 -丙氨酸代謝工程的調(diào)控機(jī)制-丙氨酸生產(chǎn)的代謝工程策略可歸納如下：增加前體物質(zhì)的合成，輔因子ATP、CO2和NADH/NAD+的平衡，減弱競(jìng)爭(zhēng)途徑。2.1 增加前體物質(zhì)的合成過表達(dá)生物合成途徑中關(guān)鍵酶的編碼基因，通常是增加前體物質(zhì)最有效的策略，該策略在代謝工程中的應(yīng)用使-丙氨酸的產(chǎn)量得到了大幅度提高。在大腸桿菌-丙氨酸的合成代謝途徑中，L-天冬氨酸是其直接前體物質(zhì)。當(dāng)增加L-天冬氨酸濃度，PanD與底物的親和力協(xié)同性增大，從而能夠抵消抑制劑的影響，顯著增加-丙氨酸的產(chǎn)量。L-天冬氨酸是在PPC作用下由草酰乙酸合成，異源過表達(dá)谷氨酸棒狀桿菌ppc基因顯著提高L-天冬氨

5、酸的生成，進(jìn)而增加-丙氨酸的產(chǎn)量，達(dá)0.36 g/L41。當(dāng)以葡萄糖作為碳源時(shí)，敲除編碼葡萄糖特異性PTS酶(glucose-specific PTS enzyme，PtsG)，PtsG可調(diào)節(jié)菌體碳氮代謝，顯著增強(qiáng)PPC的活性，從而提高了下游產(chǎn)物草酰乙酸的積累量，使-丙氨酸的產(chǎn)量增加兩倍，達(dá)到1.45 g/L10。在敲除PtsG系統(tǒng)的同時(shí)，葡萄糖的攝取途徑可以使用葡萄糖激酶(glucokinase，Glk)進(jìn)行取代，這些改造用于維持氧化還原平衡的PEP，以及通過消除需要從丙酮酸產(chǎn)生額外的PEP來(lái)提高能源效率，使-丙氨酸產(chǎn)量提高了1.33 g/L41。由于草酰乙酸除了通過PPC催化磷酸烯醇式丙酮

6、酸羧化而來(lái)，還可以以丙酮酸為底物，通過丙酮酸羧化酶催化生成。pyc的高水平表達(dá)可以主導(dǎo)CO2固定并可以增加ATP產(chǎn)率(每1分子草酰乙酸產(chǎn)生1個(gè)ATP)。梁姍姍39在E.coli中過表達(dá)Lactobacillus來(lái)源的pyc基因增加丙酮酸到草酰乙酸的代謝流，可使-丙氨酸產(chǎn)量提高到5.4 mg/L。在菌株代謝中，L-天冬氨酸合成的另一途徑是延胡索酸在天冬氨酸裂解酶的催化下生成L-天冬氨酸，此反應(yīng)為可逆反應(yīng)，L-天冬氨酸在一定程度上亦可以生成延胡索酸，通過敲除此途徑，避免L-天冬氨酸外泄，可少量增加-丙氨酸含量(0.61 g/L)41。在隨后的研究中，為了進(jìn)一步增加L-天冬氨酸的生物合成，彌補(bǔ)Asp

7、A活性的不足，增強(qiáng)aspA表達(dá)，使TCA循環(huán)的中間代謝物-丙氨酸產(chǎn)量提高0.51 g/L13,42。2.2 增加拷貝數(shù)及調(diào)節(jié)啟動(dòng)子除此之外，還可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)節(jié)酶表達(dá)，以解決-丙氨酸的生產(chǎn)問題。轉(zhuǎn)錄水平的高低主要取決于啟動(dòng)子的強(qiáng)弱以及啟動(dòng)子與RNA聚合酶的親和力，翻譯水平高低主要取決于RBS序列強(qiáng)弱、RBS序列的發(fā)卡結(jié)構(gòu)和SD序列與ATG之間特異性的序列43。粱珊珊39采用PL啟動(dòng)子溫度調(diào)控兩階段發(fā)酵轉(zhuǎn)換，敲除或過表達(dá)相關(guān)基因后，發(fā)酵后產(chǎn)量達(dá)到18.4 g/L。SONG等10通過使用合成啟動(dòng)子和RBS序列優(yōu)化ppc的表達(dá)水平，使-丙氨酸產(chǎn)量增加到3.94 g/L。QIAN44則通過調(diào)節(jié)

8、aspC基因表達(dá)的RBS以及panD基因的拷貝數(shù)，優(yōu)化2種基因在E.coli中的表達(dá)，最終在5 L生物反應(yīng)器中得到了80.4 g/L產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化率達(dá)到95.3%。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)panD拷貝數(shù)的變化也是影響-丙氨酸產(chǎn)量的關(guān)鍵。當(dāng)增加EcopanD基因拷貝數(shù)，WpTrc-3ED上清液中-丙氨酸質(zhì)量濃度(0.56 g/L)顯著高于WpTrc-2ED中(0.21 g/L)，且菌株生長(zhǎng)量在發(fā)酵48 h時(shí)顯著高于WpTrc-2ED菌株生長(zhǎng)量。而對(duì)于BsupanD，WpTrc-BD菌株的-丙氨酸產(chǎn)量為1.61 g/L，WpTrc-2BD菌株的-丙氨酸合成量達(dá)到1.68 g/L，而WpTrc-3BD菌株中-丙氨酸

9、合成量為2.10 g/L，顯著高于WpTrc-2BD菌株的-丙氨酸濃度。因此，通過增加panD基因拷貝數(shù)可以顯著提高-丙氨酸的產(chǎn)量。2.3 輔因子ATP、CO2和NADH/NAD+的平衡NADPH是代謝網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵輔因子之一，在氨基酸產(chǎn)生株的生化反應(yīng)和生理功能中起著重要作用。對(duì)NADPH的可用性和形式的操作是在工業(yè)菌株中將碳通量轉(zhuǎn)向氨基酸生物合成的一種有效和簡(jiǎn)單的方法45。從葡萄糖合成-丙氨酸的代謝過程中伴隨著NAD+/NADH的相互轉(zhuǎn)化，葡萄糖進(jìn)入體內(nèi)，經(jīng)過糖酵解途徑中3-磷酸甘油醛生成NADH，接著丙酮酸合成乙酰輔酶A過程也釋放NADH，后續(xù)草酰乙酸合成L-天冬氨酸過程中則需要消耗NADH。

10、過表達(dá)碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因(BT)和碳酸酐酶基因(CA)增強(qiáng)CO2/碳酸氫鹽同化的同時(shí)，引入一個(gè)輔因子自給系統(tǒng)-天冬氨酸脫氫酶(aaspartate dehydrogenase，AspDH)，該系統(tǒng)可以分別同時(shí)再生NAD+和L-谷氨酸用于糖酵解和AspC，更有效地驅(qū)動(dòng)L-天冬氨酸生成反應(yīng)，將-丙氨酸產(chǎn)量提高到3.54 g/L39。敲除ldhA基因以平衡NADH輔酶代謝的不平衡，可以有效提高-丙氨酸產(chǎn)量至2.37 g/L40。同時(shí)在異源過表達(dá)pyc基因時(shí)，期間會(huì)消耗1分子CO2，而由L-天冬氨酸通過PanD合成-丙氨酸途徑時(shí)產(chǎn)生1分子CO2，因此，增加pyc基因的表達(dá)將有助于CO2的平衡。2.4

11、減弱競(jìng)爭(zhēng)途徑在整個(gè)細(xì)胞的代謝工程中，通過敲除對(duì)競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑關(guān)鍵的基因，將碳通量重新分配到目標(biāo)產(chǎn)品，被廣泛應(yīng)用于代謝重新設(shè)計(jì)策略。大腸桿菌的基因敲除方法主要是通過CRISPR/Cas9技術(shù)，將競(jìng)爭(zhēng)途徑的關(guān)鍵基因進(jìn)行敲除或是弱化，此策略已經(jīng)成功應(yīng)用于生產(chǎn)各種氨基酸的生產(chǎn)菌株，可成功減少副產(chǎn)物的生成。大腸桿菌的ldhA、poxB和pflB編碼的酶共同競(jìng)爭(zhēng)底物丙酮酸，使代謝通路流向乳酸、甲酸、乙醇等副產(chǎn)物。在野生型大腸桿菌B001640中刪除醋酸鹽、甲酸鹽、乙醇和乳酸鹽的副產(chǎn)品路線，可使L-天冬氨酸產(chǎn)量增加，進(jìn)而增加目標(biāo)產(chǎn)物。除此之外，大腸桿菌LysC和AspA的共同底物為L(zhǎng)-天冬氨酸，使途徑流向L-

12、賴氨酸和L-甲硫氨酸等副產(chǎn)物。ZOU等13淘汰了3個(gè)原生的天冬氨酸激酶基因，通過防止天冬氨酸旁路的丟失，促進(jìn)-丙氨酸的產(chǎn)量提高了1.67 g/L。此外，敲除panC基因并適當(dāng)添加泛酸也是一種增加-丙氨酸濃度的策略。另一個(gè)典型案例是梁珊珊39構(gòu)建的重組大腸桿菌菌株B0016-092B (ackA-ptapflBadhEfrdAldhAlysCpanCaspAptsG)經(jīng)厭氧搖瓶發(fā)酵，使-丙氨酸產(chǎn)量達(dá)到0.9 mg/L。3 前景與展望-丙氨酸在各個(gè)領(lǐng)域均被廣泛應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)前景。在國(guó)內(nèi)，各大廠商合成-丙氨酸的方法主要為化學(xué)合成法，但其污染嚴(yán)重且成本較高，不符合綠色、可持續(xù)發(fā)展的要求。近年來(lái)，

13、隨著微生物發(fā)酵工程的不斷發(fā)展，研究者逐漸將目光放在使用基因工程菌生產(chǎn)的-丙氨酸的研究上，但是目前的研究進(jìn)展還不能達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的水平?；蚬こ叹?丙氨酸合成途徑的相關(guān)調(diào)控多數(shù)已被解析。但是在前體物質(zhì)合成和輔因子NADPH和ATP的提供等方面需進(jìn)一步探究。隨著基因編輯等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以及系統(tǒng)生物學(xué)，合成生物學(xué)的多種平臺(tái)的利用，將不同生物中的優(yōu)勢(shì)途徑進(jìn)行改造和組合是-丙氨酸產(chǎn)量提高的一個(gè)關(guān)鍵。對(duì)于-丙氨酸的優(yōu)勢(shì)途徑主要有：前體物質(zhì)的增加、輔因子的平衡和副產(chǎn)物的減少，單獨(dú)采取優(yōu)勢(shì)途徑或是對(duì)優(yōu)勢(shì)途徑進(jìn)行整合改造均可提高-丙氨酸的產(chǎn)量。ZOU等13采用前體物質(zhì)和副產(chǎn)物的綜合策略，通過分批補(bǔ)料發(fā)

14、酵獲得了43.12 g/L的-丙氨酸。PIAO等41采取3個(gè)優(yōu)勢(shì)途徑均進(jìn)行優(yōu)化改造的方式，過表達(dá)ppc、glk、aspC和panD基因，敲除posB、ldhA、pflB和aspA等副產(chǎn)物生成基因，將前體物質(zhì)的碳通量最大限度的轉(zhuǎn)移到-丙氨酸代謝途徑，同時(shí)過表達(dá)BT和CA增強(qiáng)CO2/碳酸氫鹽同化，增加輔因子自給自足系統(tǒng)，構(gòu)建菌株將-丙氨酸質(zhì)量濃度提高到37.7 g/L。其中，PanD作為關(guān)鍵酶，已做了廣泛的研究。PanD需要自剪切才能完成激活，其中V23，I26，T27和E56這4個(gè)位點(diǎn)的殘基對(duì)于PanD的自切割過程尤其重要33，且來(lái)自枯草芽孢桿菌(PanDBs)的酶具有更高的比活度和熱穩(wěn)定性34，經(jīng)過后續(xù)研究，已獲得各種突變體提高其酶活力和穩(wěn)定性，為后續(xù)研究打下了基礎(chǔ)