廣州大學轉化子篩選設計

1、3。通過菌落直接PCR從轉化子中篩選出轉基因生物，擴增出特殊目的基因片段，判斷所得轉化子是否為重組子。但因PCR技術的高靈敏性，往往會產生假陽性結果，所以有必要進一步進行鑒定。從疑似重組子中進行搖菌培養(yǎng)觀察菌株表達形態(tài)，若出現(xiàn)熒光蛋白則說明菌株成功轉化并表達了EGFP增強型熒光蛋白。2材料與方法2.1 實驗材料E. coli DH5菌株：R-，M-，Amp-；實驗五的連接產物： pMD19-T + EGFP2.2 試劑含氨芐青霉素(Amp, 100mg/L)的LB固體培養(yǎng)基；X-gal儲存液（200mg/ml）；IPTG儲存液（20mg/ml）；0.1 mol/L CaCl2溶液2.3 儀器無

2、菌操作臺；電泳系統(tǒng)，凝膠成象系統(tǒng)(BIO-RAD Co.)，移液槍（Dragon Co.），滅菌的PCR管，離心管，槍頭等2.4 轉化產物的涂布在事先制備好的含100 mg/L Amp的LB平板表面（中央位置）加40l X-gal儲存液和4 l IPTG儲存液，用無菌玻棒將溶液涂布均勻，置于超凈工作臺上，使培養(yǎng)基表面的液體完全被吸收。取500 l復壯后的轉化菌液（實驗六：感受態(tài)細胞的制備和轉化）涂布于篩選培養(yǎng)基表面，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，用封口膜封住培養(yǎng)皿邊緣，倒置培養(yǎng)皿，37培養(yǎng)過夜。2.5 轉化子的藍白斑篩選含有Amp的篩選培養(yǎng)基中長出的菌落中挑選出5個白色單菌落，并做好標記，這5個單

3、菌落即為可疑轉化子。2.6 菌落直接PCR在PCR管中配制50L反應體系。反應體系如下：10PCR buffer 5l；dNTP mixture 4l；前向引物(P1：EGFP-F: 5-TAGTCGACTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3(Tm=65.5)(SalI)2l；反向引物(P2:EGFP-R:5-GCGTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3(Tm=61.5)(Xba I) ) 2l；rTaq酶 0.5l；滅菌蒸餾水 36.5l。將上述體系輕輕混勻,稍離心即可。然后按每管10L分裝至5個反應體系。最后用無菌牙簽把5個白色單菌落挑出并分別加入5個反應體

4、系中（每個菌落僅挑出1/2面積，即在LB平板上剩余1/2用于后續(xù)培養(yǎng)實驗）。為了防止PCR反應過程中熱蓋效果不佳導致混合液蒸發(fā),最后在每個反應體系中添加10L礦物油。PCR儀的參數設置為：94 2min，94 30s；61 30s；72 45s（40個循環(huán)），72 5min，10 save2.7 瓊脂糖凝膠電泳結果觀察各管中取10l PCR產物并與1l 10loading buffer充分混合，并將混合物進行上樣工序，以電壓110V電泳15min，隨后進行2瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將電泳完成的瓊脂糖膠板放置紫外線下進行觀察拍攝。 2.8 轉化子的培養(yǎng)把電泳結果中有熒光條帶的2個樣品分別接種到裝有

5、已加入氨芐青霉素的15ml LB液態(tài)培養(yǎng)基的錐形瓶，然后將錐形瓶放置到搖床中過夜恒溫培養(yǎng)，于第二天觀察菌株生長情況。3結果和分析3.1 藍白斑篩選結果圖1藍白斑篩選結果fig 2 Results of Blue-White spot screening 3.2 電泳結果圖2 本組菌落直接PCR后的瓊脂糖電泳結果（1、2、3、4、5為挑選菌落）fig 2 Results of agarose electrophoresis using 5 Colony PCR products of this group圖3 平衡組菌落直接PCR后的瓊脂糖電泳結果fig 3 Results of agarose

6、 electrophoresis using 5 Colony PCR products of parallel groups3.3 LB（含Amp）培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)結果圖4 搖瓶培養(yǎng)的菌落生長情況Fig 4 The growth condition of E.coli using Shake flask culture3.4 藍白斑篩選結果分析由圖一所示，本實驗LB平板上成功出現(xiàn)了藍色菌落和白色菌落。并隨后挑選其中靠近藍色菌落的5處白色菌落進行后續(xù)菌落PCR和搖瓶培養(yǎng)。本實驗采用的載體質粒是經Takara公司改良后的 pMD19-T Vector，與pMD18-T Vector相比，-半乳糖苷

7、酶的表達活性更高，菌落顯示藍色的時間縮短，菌落顯示的藍色更深。本實驗中pMD19-T Vector涂板培養(yǎng)約24小時（37）。當外源EGFP DNA片段成功插入至pMD19-T Vector并進入到宿主E.coli使其成為轉化子后，一般情況下-半乳糖苷酶的表達將受到破壞，重組克隆體在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)時將顯示白色菌落。但根據Takara pMD19-T Vector使用說明書介紹，有時比較短的DNA片段插入載體時，基因的讀碼框有可能正好與LacZ的讀碼框相吻合，克隆體也會顯示藍色菌落。有報道稱，2 kb的DNA片段插入到載體中后，重組克隆體仍顯示了藍色。

8、所以，進行陽性克隆檢測時，盡管藍白斑篩選實驗已經成功地對轉化子進行初篩，成為鑒定轉化子的方法之一，但為降低假陽性造成的干擾。我們要進一步使用PCR的方法。3.4 菌落PCR電泳結果分析根據圖2的電泳結果可知，本人組連同另外4個平行組均未電泳出正常的圖譜，該判斷依據在于Marker DL 2000泳道亦未出現(xiàn)100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp的預期清晰圖譜。由此推斷，電泳儀在工作過程中出現(xiàn)了不可預計錯誤，導致電泳儀無法正常工作，原因可能是電泳液濃度不均或存在過多的瓊脂糖沉淀阻塞導致局部電壓不均勻，使DNA分子不能正常向負極移動。由于本實驗擴增用引物采用了P

9、1：EGFP-F: 5-TAGTCGACTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3(Tm=65.5) (Sal I)；P2：EGFP-R: 5-GCGTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3(Tm=61.5) (Xba I)，目的是通過瓊脂糖凝膠電泳觀察是否擴增出EGFP基因片段大小的圖譜，故根據平行組實驗結果（圖3），可以觀察到EGFP DNA片段的電泳圖譜。說明菌落直接PCR成功鑒定出含pMD19T-EGFP質粒的大腸桿菌DH5。即已經成功鑒定出轉化子。3.4 搖瓶培養(yǎng)結果由于本組實驗中電泳儀工作出錯導致菌落PCR的電泳結果無法成功鑒定轉化子。故本實驗根據電泳圖中

10、的輕微疑似圖譜，挑選1號和3號白色菌落進行搖瓶培養(yǎng)。經過24小時（37）的搖瓶培養(yǎng)后，再對錐形瓶內產物進行藍光照射觀察其熒光效果。結果表明（圖4），3號菌落為含pMD19T-EGFP質粒的大腸桿菌DH5，能成功產生增強型熒光蛋白EGFP，而1號菌落為假陽性白色菌落，不含pMD19T-EGFP質粒或不含有pMD19T Vector中不含有EGFP基因。綜合以上實驗結果證明，搖瓶培養(yǎng)最終成功鑒定并篩選出目的轉化子。4討論與小結本次綜合實驗成功的篩選并鑒定出號菌是成功的pMD19T-EGFP轉化子大腸桿菌DH5，達到了實驗預期結果。通過藍白斑篩選、菌落直接PCR、搖瓶培養(yǎng)3個鑒定篩選轉化子的方法，實

11、質上是循序漸進地去精確篩選出目的轉化子的過程。3個步驟連貫配合，共同對假陽性結果進行排除，一步一步對干擾實驗結果的因素進行排除，從而達到實驗目的。最終成功精確地篩選出能表達出EGFP的目的轉基因菌株。參考文獻Shimomura O. Structure of the chromophore of Aequorea, green fluorescent proteinJ. Febs Letters, 1979, 104(2):220-222.薛啟漢. 綠色熒光蛋白(GFP)的特性及其在分子生物學研究中的應用J. 江蘇農業(yè)學報, 1999(1):52-58.田長恩. 生物工程上游技術實驗手冊M. 科學出版社,