人工關節(jié)金屬磨損顆粒體外制備分離方法的實驗研究

1、人工關節(jié)金屬磨損顆粒體外制備別離方法的實驗研究【摘要】設計一種體外制備、別離人工關節(jié)金屬磨損顆粒的方法，并驗證這種顆粒用于醫(yī)學實驗的可行性。方法用鈦鋁釩合金、鈷鉻鉬合金材料分別制成球磨罐(國家創(chuàng)造專利，申請?zhí)枺?3142073.7),球磨罐內(nèi)裝有用同種材料制成的磨塊;向該球磨罐內(nèi)注入模擬生物體液;震動球磨得到顆?；鞈乙骸Ｌ荻入x心獲得金屬顆粒。對顆粒進展：(1)元素成分鑒定；(2)顆粒大小鑒定和粒度分析；(3)掃描電鏡對顆粒的外表形態(tài)觀察；(4)將顆粒與J774A.1巨噬細胞共同培養(yǎng)，觀察細胞吞噬顆粒的情況。結果通過此方法成功產(chǎn)生并別離出大量直徑1左右的鈦合金和鈷鉻鉬合金顆粒。(1)元素分析證實

2、整個處理過程中無雜質成分污染；(2)鈦合金顆粒的平均直徑Dv901.009，鈷鉻鉬顆粒的平均直徑Dv901.008，粒度分布曲線根本成正態(tài)；(3)掃描電鏡圖象顯示顆粒大小均勻，形狀多為不規(guī)那么，與體內(nèi)顆粒極為相似；(4)J774A.1巨噬細胞能完好吞噬2種材料的顆粒。結論此方法能持續(xù)大量產(chǎn)生人工關節(jié)假體金屬材料的磨損顆粒，產(chǎn)生的顆粒能在各方面很好地模擬體內(nèi)磨損顆粒，為今后人工關節(jié)假體松動相關研究的體內(nèi)、體外研究提供可靠的顆粒來源?！娟P鍵詞】人工關節(jié)生物相容性材料磨損顆粒體內(nèi)研究體外研究Keyrds：artifitialjint;biehanialreeptiveaterial;earparti

3、le;inviv;invitr人工關節(jié)假體晚期松動是長期困擾骨科領域的難題。長期的研究形成共識：假體材料磨損顆粒引發(fā)的由巨噬細胞介導的破骨細胞性骨吸收是假體松動的主要生物學原因1。隨著各種新型生物金屬材料的不斷產(chǎn)生和人們對金屬-金屬人工關節(jié)假體的重新評價，細小金屬顆粒在假體松動中的作用又成為了研究的熱點2，3。為解決人工關節(jié)松動相關研究中顆粒來源匱乏的問題，本研究在參考Rgers4方法的根底上設計出一種體外產(chǎn)生生物金屬材料細小磨損顆粒的方法，采用此方法成功制成了直徑1的鈦合金和鈷鉻鉬合金顆粒。并對顆粒的成份、大孝形態(tài)和粒度分布進展分析觀察。顆粒與巨噬細胞體外培養(yǎng)中觀察吞噬的方法初步驗證顆粒用于

4、醫(yī)學實驗的可行性。1材料與方法1.1顆粒制備裝置的研制原料選用醫(yī)用鈦鋁釩合金上海思愛高科技開發(fā)提供和鈷鉻鉬合金北京力達康科技提供。采用非焊接技術制成3個中空的橢球形球磨罐1007070和立方形磨塊假設干555。頂部開口處采用螺紋旋入式頂蓋，加用聚乙烯的墊圈，以進步系統(tǒng)的密封性能，在設計上確保聚乙烯墊圈不外露于容器的內(nèi)壁，以防止混入聚乙烯磨損顆粒。底部支架使磨罐能在平面放置圖1、2。本裝置的所有組件按ASTF86-76標準進展清洗，75%酒精浸泡，高溫滅菌121、15in后備用。生物金屬顆粒產(chǎn)生裝置及別離保存方法已申請國家創(chuàng)造專利。創(chuàng)造名稱：一種生物金屬材料超細粉末的制備方法及其制備裝置。專利申

5、請?zhí)枺?3142073.71.2磨損顆粒的制備、離心別離與保存無菌條件下翻開頂蓋，將磨塊放入球磨罐中，參加事先配制好模擬生物體液PBS+2%小牛血清+5IU/l青霉素+5g/l鏈霉素75l作為光滑液。裝置至于搖床上，搖擺72h，棄掉光滑液，重新參加光滑液75l，搖擺21d。搜集光滑液與磨損顆粒的混懸液，加光滑液至80l待用。將鈷鉻鉬合金混懸液80l分裝在8個10l的試管中，500r/in離心2in，棄沉淀物，重新加光滑液至10l，重復2次。1000r/in離心5in，棄上清，重新加光滑液至10l,重復1000r/in離心5in1次，加光滑液至4l,-20凍存?zhèn)溆?。將鈦合金混懸?0l分裝在8個

6、10l的試管中，500r/in離心4in，棄沉淀物，重新加光滑液至10l，重復2次。1000r/in離心40in，棄上清，重新加光滑液至10l,重復1000r/in離心40in一次，加光滑液至4l,-20凍存?zhèn)溆谩?.3磨損顆粒成分元素分析隨機抽樣選取鈦鋁釩合金原料和磨損顆粒樣品各一份進展元素分析。秤取0.1g原料和磨損顆粒樣品，于聚四氟乙烯燒杯中，參加10lHF分析純，加熱1h，參加10lH2S4(GR),加熱1h，定容于500l容量瓶中。取液進入等離子體發(fā)射光譜儀IRISAdvantage1000美國，儀器自動讀出樣品元素組成。1.4磨損顆粒的粒度分析1.5磨損顆粒的掃描電鏡觀察1.6巨噬

7、細胞培養(yǎng)與吞噬實驗J774A.1巨噬細胞株來源于BALB/小鼠網(wǎng)狀細胞肉瘤，由AerianTypeulturelletin.Rkville,D,USA提供，培養(yǎng)在含10%小牛血清、100g/l青霉素、100g/l鏈霉素和2%谷氨酰胺的DE培養(yǎng)液，于37、5%2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。搜集對數(shù)生長期的細胞，以2105/l接種于6孔板中，培養(yǎng)46h后，參加體外制備的鈷鉻鉬合金顆?；鞈乙?07個/孔，另外于35培養(yǎng)皿中按上述方法接種細胞，刺激24h后用2.5%戊二醛溶液固定，進展倒置相差顯微鏡觀察。同時設置不加任何刺激物的對照孔。1.7巨噬細胞透射電鏡觀察J774A.1巨噬細胞分別參加鈷鉻鉬合金顆粒混

8、懸液和鈦鋁釩合金顆?；鞈乙?07個/孔，作用24h后用2.5%戊二醛溶液固定。用橡皮刮子將全部細胞從皿底輕輕刮下，搜集在離心管中離心2000r/in20in，棄上清，將沉淀的細胞團塊取出，用棉花紙包裹起來，然后進展漂洗、1%鋨酸后固定15in、漂洗、脫水、浸透，將樣品從棉花紙內(nèi)取出進展包埋，60烘箱內(nèi)48h，超薄切片，透射電鏡HITAHIH-500日本觀察并攝像。2結果2.1磨損顆粒成分元素分析分析結果顯示：實驗中獲得的鈦鋁釩合金顆粒的元素構成與其原料根本一樣表1，證實磨損顆粒的產(chǎn)生過程中無雜質元素污染。表1鈦鋁釩合金磨損顆粒的元素分析結果2.2磨損顆粒的粒度分析鈦鋁釩顆粒的平均直徑Dv901

9、.009，99.93%的顆粒直徑在0.31.2之間；鈷鉻鉬顆粒的平均直徑Dv901.008，99.93%的顆粒直徑在0.31.2之間；2種顆粒粒度分布曲線形態(tài)非常相似圖3、4。2.3磨損顆粒的掃描電鏡觀察鏡下可見體外制備的鈦鋁釩合金顆粒呈片狀、盤狀、柱狀、針狀等各種不規(guī)那么形狀，外表有低密度的血清蛋白沉積圖5。未見明顯的顆粒疊加和成團聚集的情況。大小顆粒在濾膜上分布不均勻，大顆粒集中在邊緣上，小顆粒集中在中心部位。轉貼于論文聯(lián)盟.ll.體外制造的鈷鉻鉬合金顆粒也有片狀、盤狀、柱狀、針狀等各種不規(guī)那么形狀，鈷鉻鉬合金顆粒更多為塊狀顆粒，是由于顆粒輕度聚集，顯得體積更大圖6。與體內(nèi)別離顆粒對照發(fā)現(xiàn)

10、，顆粒的形態(tài)均非常近似，外表都有蛋白沉積。體內(nèi)別離顆粒大小分布更加不均勻圖7。2.4巨噬細胞培養(yǎng)與吞噬實驗J774A.1巨噬細胞經(jīng)適宜的條件培養(yǎng)24h后細胞生長旺盛，吞噬活性較強。倒置相差顯微鏡下細胞成圓形或橢圓形，細胞輪廓明晰，胞漿內(nèi)無明顯吞噬小體圖8。與體外制備的鈷鉻鉬顆粒共同培養(yǎng)24h后，鏡下細胞形態(tài)發(fā)生變化。細胞密度減小，細胞腫脹成圓形，胞核變大，甚至見到細胞大片壞死，核溶解，細胞碎裂，胞漿內(nèi)有被吞噬的鈷鉻鉬顆粒影像圖9。2.5培養(yǎng)的巨噬細胞透射電鏡觀察當金屬顆粒接近J774A.1巨噬細胞時，細胞伸出偽足逐漸將較小的顆粒吞噬入細胞內(nèi)。此時細胞開場張大，胞漿內(nèi)線粒體和粗面內(nèi)質網(wǎng)增生，表示

11、分泌活動活潑，顆粒進入細胞成為吞噬體。胞漿密度變得不均勻，有空泡樣變圖10。3討論為說明假體松動的機理和對新型假體材料的生物相容性進展評價，眾多學者采用體外細胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、體內(nèi)植入等方法對顆粒引發(fā)的生物學反響進展研究57。由于體內(nèi)顆粒來源有限，國內(nèi)學者常采用簡單的材料對磨、過篩或承受國外贈送的方法體外獲得顆粒，而國外學者采用的方法有對磨illing、金屬熔體霧化aerslizatin、氣化gasatizatin、激光制粉法等4。由于來源雜亂，顆粒的各項特性變異較大，使大量的實驗數(shù)據(jù)因無法重復和比擬而失去實際意義。如何體外產(chǎn)生生物金屬的顆粒并使之能很好地模擬體內(nèi)顆粒是一個普遍地急需解決的問題

12、。大量的研究已經(jīng)顯示：磨損顆粒的物理、化學性質是影響機體反響程度和假體松動的關鍵因素。這些性質包括：顆粒數(shù)量、大孝粒度分布、外表積、化學元素構成、外表形態(tài)、可溶性金屬離子釋放、外表電荷等5。使體外生成的顆粒最大限度地模擬體內(nèi)磨損顆粒是作者設計這個方法時始終堅持的原那么。3.1顆粒的產(chǎn)生方法人工關節(jié)周圍的金屬磨損顆?？梢詠碓从陉P節(jié)面、柄-骨界面、假體-骨水泥界面、臼杯-骨界面、組合式假體的柄-頭結合處。從磨損機理上講屬于外表摩擦磨損，因此借鑒工業(yè)球磨的方法產(chǎn)生顆粒是合理的。作者自行設計的球磨罐具有以下特點：(1)采用一樣的材料加工球磨罐和磨塊，無焊接工藝和罐口的密封裝置防止了任何其它材料參與摩擦

13、，保證了顆粒的純潔；(2)光滑液采用PBS+2%小牛血清+5IU/l青霉素+5g/l鏈霉素，動物血清對顆粒進展預孵化(prEinubatin)，經(jīng)蛋白孵化的顆粒的生物學行為更接近體內(nèi)顆粒。在理論中作者發(fā)現(xiàn)，預孵化過程能在顆粒外表形成蛋白保護膜，明顯減少顆粒的聚集成團現(xiàn)象，有利于顆粒的離心別離和電鏡觀察；(3)本裝置的所有組件按ASTF86-76標準進展清洗，75%酒精浸泡，高溫滅菌，無菌操作過程和含抗生素的光滑液都保證了顆粒無微生物和內(nèi)毒素污染，這對于體內(nèi)和體外醫(yī)學實驗是非常重要的；(4)低能量緩慢搖擺和光滑液的參加，使磨塊與罐壁、磨塊與磨塊之間進展緩慢的摩擦，產(chǎn)生細小的顆粒，挑選效率進步。3

14、.2顆粒的別離方法本實驗采用“梯度離心的方法對顆粒進展篩眩其原理來自于Stkes法那么：R2=9h/(2t-02n)R：顆粒半徑：光滑液黏滯度h：樣品高度t：離心時間：金屬密度0：光滑液密度：離心角速度n：樣品與旋轉軸間隔 本實驗中的常規(guī)變量只有和t，因此公式簡化為：R2=4.5106/t(in)2(r/in)RTi2=9.0106/t(in)2(r/in)R：鈷鉻鉬合金顆粒半徑RTi：鈦合金顆粒半徑t：離心時間：離心角速度總之，本實驗方法簡單，設備要求不高，利于應用和推廣。3.3顆粒的粒度測定方法傳統(tǒng)的顆粒測定方法是在光鏡或電鏡下對顆粒進展直接計數(shù)，工作量大、準確度差。激光粒度儀利用測定激光

15、束穿透顆?；鞈乙旱纳⑸涔烙嫵鲱w粒的平均體積，如假設顆粒為標準球體，那么可計算出顆粒直徑。在應用中作者認為粒度儀用于人工關節(jié)顆粒分析的優(yōu)勢在于：測量速度快、誤差孝可定量分析、操作簡單，非常合適大量樣本的檢測與比照研究。激光粒度儀是確定顆粒大小的有效方法，但在應用中仍需注意：(1)激光粒度儀是在忽略顆粒形狀差異的根底上對顆粒大小的計算和估計，所以顆粒形狀對于結果有影響。光鏡或電鏡下對顆粒進展直接計數(shù)的方法可以彌補上述缺乏，并可以獲得顆粒形態(tài)的直觀資料，兩者可以取長補短；(2)由于金屬顆粒的密度大，在液體中沉降迅速，也給結果帶來偏向。所以注意別離好的顆?；鞈乙阂M快進展測定，測定前再次震蕩混勻，有條

16、件時可以選取甘油等高黏度懸浮液。3.4開展方向展望隨著各種新型生物金屬材料的不斷產(chǎn)生和人們對金屬-金屬和陶瓷-陶瓷人工關節(jié)假體的重新評價，細小金屬和陶瓷顆粒在假體松動中的作用又成為了研究的熱點2，3。為適應這一研究開展的需要，作者正在研究能產(chǎn)生更加細小金屬和陶瓷顆粒直徑25n左右的方法。圖1鈦鋁釩合金球磨罐和磨塊圖2鈷鉻鉬合金球磨罐和磨塊圖3鈦鋁釩顆粒平均直徑Dv901.009，99.93%的顆粒直徑在0.31.2之間圖4鈷鉻鉬顆粒平均直徑Dv901.008，99.93%的顆粒直徑在0.31.2之間圖5體外人工制造的鈦鋁釩合金顆粒掃描電鏡顯示：顆粒呈片狀、盤狀、柱狀、針狀等各種不規(guī)那么形狀，外表有低密度的血清蛋白沉積2000圖6體外制備鈷鉻鉬合金顆粒掃描電鏡，鉻鉬合金顆粒更多為塊狀顆粒，是由于顆粒輕度聚集，顯得體積更大2000圖7體內(nèi)別離與體外制備的鈦鋁釩顆粒掃描電鏡比擬圖7aR為體內(nèi)別離顆粒圖7b為體外制備顆粒。顆粒的形態(tài)均非常