金絲桃素對慢性高眼壓兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞保護作用的組織學(xué)觀察

1、金絲桃素對慢性高眼壓兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞保護作用的組織學(xué)觀察【摘要】目的：探究金絲桃素對慢性高眼壓兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的影響。方法：取成年家兔20只，后房內(nèi)注射-糜蛋白酶，建立兔慢性高眼壓模型。造模成功的兔眼在10d后玻璃體內(nèi)分別注入金絲桃素0.1L或生理鹽水0.1L，1次/k，連續(xù)2k。另用4只正常兔做空白對照。最后光鏡電鏡觀察視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的構(gòu)造變化及視網(wǎng)膜內(nèi)層平均厚度的變化。結(jié)果：生理鹽水對照組節(jié)細胞數(shù)量減少，部分嚴重變性，染色質(zhì)邊集,線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器嚴重腫脹,視網(wǎng)膜內(nèi)層平均厚度變保金絲桃素治療組節(jié)細胞形態(tài)構(gòu)造較生理鹽水對照組損傷細微,節(jié)細胞數(shù)量稍有減少,部分變性,染色質(zhì)邊集，線粒體

2、、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹較輕。視網(wǎng)膜內(nèi)層平均厚度輕度變薄,與生理鹽水對照組相比有顯著性差異(P0.01)。結(jié)論：金絲桃素作為一種特異性的蛋白激酶抑制劑，對慢性高眼壓下兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞有保護作用?！娟P(guān)鍵詞】金絲桃素慢性高眼壓視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞神經(jīng)保護兔ThehistlgybservatinntheprtetiveeffetfhyperiinnretinalganglinellinhrniularhypertensinrabbitsAbstratAI:Texplretheeffetfhyperiinnretinalganglinellinhrniularhypertensinrabbits.ETHDS:Ten

3、tyrabbitsereusedtbuildhrniularhypertensindelbypsterirhaberinjetinfalpha-hytrypsin.Tendaysaftersuessfuldelreatin,hyperiin0.1Lrsaline0.1Lasinjetedintthevitreusavityneaeekfr2eeks.Retinalganglinellftheseeyesandthatffurnralrabbiteyeserebservedbylightirspyandeletrnirspy.Thethinknessfinnerretinalayerasexai

4、ned.RESULTS:Thenuberfretinalganglinellinsaline-treatedgrupdereasedsignifiantly.Thereasseriuselldegradatinithperinulearndensatinfhratinandsellingrganelles,butthehangeasslightinhyperiin-treatedgrup.Thedifferenefthethiknessfinnerretinalayerbeteenthetgrupsassignifiant(P0.01).NLUSIN:Intravitrealinjetinfh

5、yperiinasaprtEinkinaseantagnistanprtettheretinalganglinellinhrniularhypertensinrabbits.KEYRDS:hyperiin;hrniularhypertensin;retinaganglinell;nerveprtetin;rabbits0引言青光眼是一組與眼壓升高有關(guān)的致盲性眼玻它的病理根底是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞進展性死亡。目前青光眼的治療主要是降眼壓，但是單純降眼壓并不能阻止視功能的繼續(xù)下降。隨著視神經(jīng)保護理論的提出和研究，視神經(jīng)保護治療越來越受到人們廣泛的關(guān)注1。我們就是基于視神經(jīng)保護治療的理論，討論一種蛋白激

6、酶prteinkinase，PK抑制劑金絲桃素對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的保護作用。1材料和方法1.1材料安康成年家兔24只，體質(zhì)量2.02.5kg，無眼疾，雌雄兼用，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。金絲桃素和二甲基亞砜(siga公司)、注射用糜蛋白酶上海第一生化藥業(yè)、LZL-12型手術(shù)顯微鏡鎮(zhèn)江中天光學(xué)儀器有限責(zé)任公司、Tnpen筆式眼壓計edtrniSlan公司。1.2方法安康成年家兔24只，隨機挑選20只作為實驗組，另4只作為對照組。實驗組用200g/L烏拉坦5L/kg，3in內(nèi)注入耳緣靜脈全身麻醉，每只兔隨機選一眼作實驗眼，的卡因點眼部分麻醉。用1L注射器抽取400U糜蛋白酶溶液0.

7、2L，從顳側(cè)角鞏膜緣進針，經(jīng)瞳孔至對側(cè)虹膜下注入后房，四環(huán)素眼膏涂眼。每日用Tnpen眼壓計測眼壓，眼壓在30Hg1Hg=0.133kPa以上為慢性高眼壓造模成功2。待高眼壓模型眼壓穩(wěn)定升高10d后，隨機挑選半數(shù)的高眼壓兔作玻璃體內(nèi)金絲桃素注射。金絲桃素用二甲基亞砜溶解，生理鹽水稀釋，終濃度為2l/L,避光保存。實驗兔烏拉坦全身麻醉加的卡因部分麻醉，在顯微鏡下用2L注射器，從12點鐘角膜緣后3處睫狀體平坦部進針，抽出玻璃體0.1L，注入金絲桃素0.1L。1次/k，連續(xù)2k。另一半高眼壓兔同上法操作，玻璃體內(nèi)注入生理鹽水0.1L。1次/k，連續(xù)2k。正常兔4只，不做任何眼部和全身的處理，處死后進

8、展下一步實驗。第2次玻璃體注射后7d處死兔子，摘除眼球置于冰盒內(nèi)，迅速去除眼前段，暴露并別離視網(wǎng)膜分別制作光鏡電鏡標本。光鏡標本經(jīng)40g/L福爾馬林固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡觀察并照相3。電鏡標本經(jīng)30g/L的戊二醛和10g/L的鋨酸固定，乙醇丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸雙氧鈾檸檬酸鉛染色，電鏡觀察并照相4。觀察所有家兔視網(wǎng)膜光鏡下構(gòu)造的變化并利用定量病理學(xué)的網(wǎng)格系統(tǒng)5，按J=LPPb/IA+Ib，計算視網(wǎng)膜內(nèi)界膜至外核層內(nèi)側(cè)間的間隔 ，以5次平均值(TIRL)作為視網(wǎng)膜內(nèi)層平均厚度6。統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進展統(tǒng)計學(xué)處理,結(jié)果用表示2結(jié)果

9、我們采用后房注射糜蛋白酶的方法制備兔慢性高眼壓模型。此方法高眼壓發(fā)生快、持續(xù)時間長、眼壓穩(wěn)定。采用20只兔作為實驗組造模，最終16只成功，其中一只因麻醉過量死亡，3眼壓未到達預(yù)期程度，成功率為80%。造模后眼壓一般在術(shù)后1k內(nèi)升高，實驗眼呈牛眼狀外觀，眼球變硬,睫狀充血,角膜水腫，前房加深，瞳孔散大。Tnpen筆式眼壓計測得平均眼壓為(34.122.31)Hg,高眼壓狀態(tài)至少可維持2。2.1光鏡觀察光鏡下見正常兔的視網(wǎng)膜組織構(gòu)造明晰、完好，可觀察到10層構(gòu)造，外核層細胞數(shù)量最多，內(nèi)核層細胞數(shù)量較少，節(jié)細胞為單層，形態(tài)呈類圓形圖1A。生理鹽水對照組視網(wǎng)膜內(nèi)層變薄，神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量明顯減少，細胞出現(xiàn)

10、變性，內(nèi)、外核層細胞排列稀疏，數(shù)量減少圖1B。金絲桃素治療組損傷明顯輕于生理鹽水對照組，神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量有所減少,胞核大部分存在，部分出現(xiàn)空泡樣變，內(nèi)核層和外核層構(gòu)造與正常組所見相似圖1。2.2電鏡觀察透射電鏡下見正常視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞核呈類圓形，染色質(zhì)顏色明晰，分布均勻，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細胞器形態(tài)正常，細胞膜完好(圖2A)。生理鹽水對照組神經(jīng)節(jié)細胞明顯減少，部分細胞嚴重變性，核構(gòu)造稀疏，核仁固縮及偏位，胞質(zhì)染色質(zhì)邊集，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，線粒體腫脹，嵴消失，空泡變性圖2B。金絲桃素治療組見部分核稍有變形，核染色質(zhì)略顯稀疏,顏色稍淡,線粒體空泡變性,殘存線粒體嵴,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)僅見輕度腫脹圖2。視網(wǎng)膜內(nèi)層平均厚度

11、正常組為78.621.87,金絲桃素治療組為73.805.61,生理鹽水對照組為59.302.17。后兩者相比有顯著性差異(P0.01)。圖1兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(HE200)A：空白對照組正常；B:生理鹽水對照組數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)變性；：金絲桃素治療組數(shù)量減少,胞核大部分存在圖2兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞超微構(gòu)造(TE106)A：空白對照組核居中,細胞器形態(tài)正常,細胞膜完好；B：生理鹽水對照組核仁固縮，胞質(zhì)染色質(zhì)邊集，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器腫脹；：金絲桃素治療組核染色質(zhì)濃集,線粒體空泡變性,殘存線粒體嵴3討論在臨床上作為一種抗病毒藥、抗抑郁藥應(yīng)用的金絲桃素是一種PK的特異性抑制劑，是從金絲桃家族中提取

12、的一種紫色結(jié)晶顏料7。目前已經(jīng)有研究說明，金絲桃素對增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變也有治療作用8。通過本實驗我們觀察到，應(yīng)用金絲桃素玻璃體內(nèi)注射，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的形態(tài)構(gòu)造相比生理鹽水對照組損傷明顯減輕，視網(wǎng)膜內(nèi)層平均厚度也比生理鹽水對照組厚。這說明金絲桃素可以直接增強節(jié)細胞對抗有害因素的才能，促進受損細胞的存活和功能恢復(fù)。青光眼的主要危險因素之一是病理性眼壓升高。慢性高眼壓對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷的機制主要是因為眼壓升高迫使篩板組織變形，使得節(jié)細胞軸漿流受阻于篩板，由此引起逆行運向神經(jīng)節(jié)細胞胞體的神經(jīng)營養(yǎng)性因子減少，神經(jīng)節(jié)細胞釋放谷氨酸，細胞外間隙谷氨酸蓄積，節(jié)細胞發(fā)生凋亡9-12。本實驗中生理鹽水對

13、照組節(jié)細胞數(shù)量明顯減少,部分嚴重變性,核仁固縮，胞質(zhì)染色質(zhì)邊集，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器腫脹就是細胞凋亡的早期表現(xiàn)。PK是一類鈣、磷脂依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可以通過一系列信號級聯(lián)反響對谷氨酸受體和谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白進展具有濃度和劑量依賴性的調(diào)節(jié)，使得細胞外間隙谷氨酸蓄積的同時，增強谷氨酸與其受體的作用，最終增加受體介導(dǎo)的興奮毒性，導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡13,14。反之，PK抑制劑那么可拮抗這一作用。我們已經(jīng)用實驗證實了慢性高眼壓兔不同時間點的視網(wǎng)膜谷氨酸含量都比正常值有所升高，而PK抑制劑金絲桃素能拮抗這一作用。金絲桃素對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞組織學(xué)的保護作用，很可能是通過PK抑制劑對視網(wǎng)膜

14、谷氨酸含量的抑制這一機制來實現(xiàn)的。當(dāng)然對于青光眼這種慢性疾病來說，反復(fù)玻璃體內(nèi)注射，也是有其明顯的不良后果的。因此，討論金絲桃素的作用和調(diào)控機制，研究如何發(fā)揮其對青光眼視神經(jīng)保護的治療潛力，有待于我們今后進一步研究?！緟⒖嘉墨I】1王艷.青光眼視神經(jīng)保護治療的實驗研究.眼科新進展,2002;22(3):16-182SearsD,Sears.Bld-aqueusbarrierandalpha-hytrypsinglauainrabbits.AJphthall,1974;77(3):378-3833項敏泓,鐘一聲,張興儒.燈盞細辛對兔高眼壓視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞活性的作用.眼科新進展,2022;25(5)

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