瘧原蟲(chóng)抗藥性的遺傳學(xué)研究進(jìn)展

1、瘧原蟲(chóng)抗藥性的遺傳學(xué)研究進(jìn)展關(guān)鍵詞：瘧原蟲(chóng)屬；抗瘧藥；抗藥性；基因摘要瘧原蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性是瘧疾防治中遇到的主要難題之一?？谷~酸類(lèi)抗瘧藥的抗藥性機(jī)制已根本搞清，與其作用靶酶二氫葉酸復(fù)原酶或二氫蝶酸合成酶基因點(diǎn)突變相關(guān)。喹啉類(lèi)藥物抗性影響因子尚不完全清楚。惡性瘧原蟲(chóng)5號(hào)染色體上的多藥耐藥基因1及7號(hào)染色體上的g2基因可能是抗性相關(guān)基因，但二者都不能完全解釋抗性，尚待深化研究。瘧疾的流行至今仍然非常廣泛，普及全球90多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，20億人面臨感染瘧疾的危險(xiǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年有3億5億瘧疾病例，導(dǎo)致150萬(wàn)270萬(wàn)人死亡，其中100萬(wàn)是居住在非洲的5歲以下兒童1。人類(lèi)在長(zhǎng)期理論過(guò)程中挑選了大量防治瘧疾

2、的藥物，但是，自從50年代末在東南亞和南美洲分別發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)氯喹產(chǎn)生抗藥性以后，抗氯喹惡性瘧迅速擴(kuò)散蔓延，抗藥性程度不斷增加，并且從單藥抗藥性向多藥抗藥性開(kāi)展。我國(guó)的海南、云南和廣西等盛自治區(qū)也有抗藥性瘧疾的流行。目前，瘧原蟲(chóng)對(duì)幾乎每一種抗瘧藥都產(chǎn)生了抗性，瘧疾防治形勢(shì)非常嚴(yán)峻，迫切要求我們盡快搞清抗藥性產(chǎn)生的機(jī)制，以便采取措施防止或逆轉(zhuǎn)抗藥性的發(fā)生并指導(dǎo)新藥研究。近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)的開(kāi)展及學(xué)科浸透大大推動(dòng)了瘧原蟲(chóng)抗藥性機(jī)制的遺傳學(xué)研究，本文就抗葉酸制劑及喹啉類(lèi)藥物抗性的分子機(jī)制作一綜述。1抗葉酸制劑抗性的分子機(jī)制1.1二氫葉酸復(fù)原酶DHFR基因乙胺嘧啶和環(huán)氯胍都是二氫葉酸復(fù)原酶抑制劑

3、。研究說(shuō)明，惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)兩藥產(chǎn)生抗藥性都與DHFR基因點(diǎn)突變相關(guān)，但二者存在差異2,3。迄今為止，共報(bào)道了6個(gè)DHFR基因編碼區(qū)變異：108位SerAsn或Thr,51位AsnIle,59位ysArg,16位AlaVal,164位IleLeu。單一點(diǎn)突變所致DHFR108位Ser變異成Asn即可產(chǎn)生乙胺嘧啶抗性，但對(duì)環(huán)氯胍的反響性?xún)H稍有降低。對(duì)乙胺嘧啶產(chǎn)生高度抗性那么需其他位點(diǎn)突變共存，包括51位AsnIle和或59位ysArg。而與環(huán)氯胍抗性相關(guān)的變異是DHFR108位SerThr伴隨16位AlaVal，同樣，該抗性株對(duì)乙胺嘧啶的敏感性變化不大。另外，在對(duì)乙胺嘧啶和環(huán)氯胍穿插耐藥的惡性瘧原蟲(chóng)

4、中發(fā)現(xiàn)存在多個(gè)位點(diǎn)變異：DHFR164位IleLeu,108位SerAsn,59位ysArg和或51位AsnIle。由于僅包含Asn-108和Arg-59變異的原蟲(chóng)別離物不具有環(huán)氯胍抗性，因此，認(rèn)為L(zhǎng)eu-164變異在瘧原蟲(chóng)對(duì)兩藥產(chǎn)生穿插抗性的機(jī)制中起重要作用3。1.2二氫蝶酸合成酶DHPS基因磺胺類(lèi)藥是二氫蝶酸合成酶抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)，正是由于磺胺類(lèi)藥作用的靶酶DHPS基因點(diǎn)突變，使得酶活性中心構(gòu)造域形狀改變，因此降低了對(duì)藥物的敏感性。體外低葉酸條件下實(shí)驗(yàn)說(shuō)明4，與磺胺多辛易感性降低相關(guān)的DHPS氨基酸變異主要包括581位AlaGly,436位SerPhe伴隨613位AlaThr/Ser,以及

5、436位SerAla,437位AlaGly?；前范嘈镣ǔＥc乙胺嘧啶合用于治療惡性瘧疾。對(duì)兩藥聯(lián)用的體外研究提醒，瘧原蟲(chóng)對(duì)乙胺嘧啶的易感性決定著兩藥協(xié)同作用的效果5。體內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)6，前面所述的DHFR變異類(lèi)型均存在并與抗性程度相關(guān)，而DHPS基因突變與抗性的發(fā)生沒(méi)有明顯相關(guān)性，僅在抗性程度較高的玻利維亞地區(qū)可見(jiàn)Gly-581高度流行,Gly-437和Glu-540的發(fā)生與用乙胺嘧啶-磺胺多辛治療失敗率相當(dāng)，這可能由于體外研究中葉酸和PABA程度不同于體內(nèi)。另一種解釋是Ala-436的變異可能僅在低度抗性時(shí)出現(xiàn)，且不與高度抗性時(shí)的變異Gly-437,Glu-540和Gly-581共存。因此推測(cè)，

6、DHPS變異在臨床乙胺嘧啶-磺胺多辛抗性的產(chǎn)生中不起主導(dǎo)作用。我們可以肯定，體內(nèi)乙胺嘧啶-磺胺多辛抗性與DHFR基因突變相關(guān)，然而在抗性瘧流行區(qū)治療失敗率并不像突變發(fā)生率那樣高，提示體外研究發(fā)現(xiàn)的三種變異Asn-108，Ile-51和Arg-59不能完全解釋體內(nèi)高度抗性。在玻利維亞的高度抗性病例中曾發(fā)現(xiàn)Leu-164及另外兩個(gè)新的變異Arg-50和插入30-31位間的玻利維亞重復(fù)區(qū)高度流行，提示這些變異可能是在抗性開(kāi)展的較高時(shí)期產(chǎn)生的，關(guān)系到治療的成敗。據(jù)此Ple等6提出假設(shè)，體內(nèi)乙胺嘧啶-磺胺多辛抗性程度分級(jí)R,R,R正是基于DHFR和DHPS基因突變的不斷積累。由于現(xiàn)實(shí)中惡性瘧原蟲(chóng)感染的復(fù)

7、雜性及宿主免疫與葉酸程度的影響，事實(shí)上所檢測(cè)到的抗性突變往往是穿插重疊的?？傊?，關(guān)于抗葉酸制劑的抗藥性分子機(jī)制已根本搞清。因此，我們可以根據(jù)特有的突變類(lèi)型，運(yùn)用分子生物學(xué)的方法，進(jìn)展大規(guī)模的流行病學(xué)研究，這對(duì)于鑒定某一瘧疾流行區(qū)的藥物敏感性，從而指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義；同時(shí)也可指導(dǎo)新藥設(shè)計(jì)及臨床藥物聯(lián)用，以最大限度地減少藥物抗性的發(fā)生。2喹啉類(lèi)藥物抗性的分子機(jī)制氯喹曾經(jīng)是使用最廣泛的抗瘧藥，由于抗性的開(kāi)展及傳播，在大部分地區(qū)已不再具有以往的效力。影響抗性機(jī)理最終說(shuō)明的重要因素是喹啉類(lèi)藥物作用機(jī)制還不非常清楚。不同地區(qū)的研究者報(bào)道關(guān)于氯喹抗性的一個(gè)共同特征是：抗氯喹蟲(chóng)株較敏感性蟲(chóng)株藥物聚集程度

8、降低了。因此，氯喹的轉(zhuǎn)運(yùn)和聚集不僅對(duì)其發(fā)揮抗瘧活性是必需的，而且與抗性表型親密相關(guān)，提示喹啉類(lèi)藥物抗性產(chǎn)生可能與其作用方式?jīng)]有直接關(guān)系，這與抗葉酸制劑不同。2.1惡性瘧原蟲(chóng)多藥耐藥基因pfdr1和pfdr2研究發(fā)現(xiàn)，維拉帕米一種鈣通道阻滯劑可逆轉(zhuǎn)氯喹抗藥性，促使人們考慮氯喹抗性可能與哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞多藥抗藥性DR表型相似7。研究說(shuō)明，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生DR是由于一種ATP依賴(lài)性的、與藥物外排相關(guān)的蛋白過(guò)量表達(dá)所致，稱(chēng)為P-糖蛋白，它定位于細(xì)胞外表，與許多不同類(lèi)型的化合物有親合力8。在此根底上，Krgstad等9發(fā)現(xiàn)抗氯喹株原蟲(chóng)較敏感株排出氯喹的速率快4050倍，且這種排出是能量依賴(lài)性的，并可被能量缺

9、乏及ATP阻斷劑抑制。但是也有研究顯示,抗氯喹株與敏感株藥物外排率相等10；二者藥物聚集量的差異是由于最初的藥物攝入速率不同所致11。哺乳動(dòng)物DR表型通常伴有dr基因的擴(kuò)增，導(dǎo)致其產(chǎn)物P-糖蛋白表達(dá)增加8。對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)基因的研究說(shuō)明也存在dr基因同系物，以pfdr1和pfdr2為主12，13。目前尚無(wú)證據(jù)說(shuō)明pfdr2及其表達(dá)產(chǎn)物與氯喹抗性有關(guān)，而有相當(dāng)多的研究認(rèn)為pfdr1與抗藥性機(jī)制相關(guān)。Pfdr1編碼一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量約162的蛋白，稱(chēng)為P-糖蛋白同系物1Pgh1。早期研究說(shuō)明，在一些抗氯喹株中存在pfdr1擴(kuò)增12，13。免疫熒光及免疫電鏡技術(shù)觀察pfdr1蛋白產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)Pgh1在紅內(nèi)期

10、表達(dá)，主要定位于食物泡膜上，這與它可能充當(dāng)氯喹轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的角色一致，但是定量分析不能確認(rèn)Pgh1過(guò)表達(dá)與抗藥性相關(guān)14。Fte等15對(duì)pfdr1基因3多態(tài)性及等位基因變異分析說(shuō)明，pfdr1突變與氯喹抗性表型相關(guān)，并提出存在兩種類(lèi)型抗性相關(guān)等位基因，一種可致單一氨基酸變異86位AsnTyr，為K1型；另一種那么導(dǎo)致三種氨基酸變異，1034位Serys、1042位AsnAsp和1246位AspTry,為7G8型。這可能分別代表著最早在東南亞和南美洲出現(xiàn)的氯喹抗性類(lèi)型。以此為根底，運(yùn)用單盲法研究，曾正確地預(yù)測(cè)了36份樣品中的34份的藥物易感性。Adagu等16的研究也說(shuō)明86位Tyr突變與氯喹抗性相

11、關(guān)。但是，同時(shí)有些研究不能得到一樣的結(jié)果。這提示可能pfdr1不是唯一的控制抗性的基因。氯喹抗性與pfdr1的關(guān)系尚不明確，從選自氯喹抗性親代的甲氟喹抗性株中卻發(fā)現(xiàn)有pfdr1的擴(kuò)增，并且蟲(chóng)株對(duì)甲氟喹抗性增加的同時(shí)對(duì)氯喹的易感性增加了12。Barnes等17的研究說(shuō)明，隨著原蟲(chóng)對(duì)氯喹抗性的增加，pfdr1基因拷貝數(shù)減少，甲氟喹易感性增加，這無(wú)疑加強(qiáng)了pfdr1擴(kuò)增與甲氟喹抗性的關(guān)聯(lián)。因此推測(cè)pfdr1擴(kuò)增可能與氯喹高度抗性是不相容的，Pgh1的功能可能是促進(jìn)對(duì)氯喹的易感性。將pfdr1基因轉(zhuǎn)染于異源表達(dá)系統(tǒng)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞H，使其表達(dá)惡性瘧原蟲(chóng)Pgh1，發(fā)現(xiàn)Pgh1表達(dá)伴隨有能量依賴(lài)性的藥物攝

12、入增加18，而且Pgh1就定位于轉(zhuǎn)染的H細(xì)胞溶酶體上，經(jīng)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞溶酶體內(nèi)pH值有所下降，認(rèn)為氯喹聚集增加可能是溶酶體酸化的結(jié)果，推測(cè)pfdr1可能編碼一種液泡氯化物通道。當(dāng)H細(xì)胞被攜帶有7G8型1034和1042位突變的pfdr1基因轉(zhuǎn)染時(shí)，那么發(fā)現(xiàn)氯喹易感性喪失，細(xì)胞聚集藥物及酸化溶酶體的才能減弱，這就從某種意義上證實(shí)了關(guān)于Pgh1促進(jìn)氯喹易感性的推測(cè)。但這仍缺乏以解釋抗性。Rithie等19發(fā)現(xiàn)源自氯喹抗性親代的鹵泛曲林抗株表現(xiàn)對(duì)鹵泛曲林、甲氟喹和奎寧敏感性降低而對(duì)氯喹敏感性增強(qiáng)，卻未檢測(cè)到任何pfdr1基因序列或拷貝數(shù)及Pgh1表達(dá)的變化。很明顯，關(guān)于pfdr1與喹啉類(lèi)藥物抗性

13、的關(guān)系仍有很大疑問(wèn)，可能抗性的發(fā)生有一定的地理學(xué)根底，而尋找某個(gè)單一的基因來(lái)解釋抗性本身過(guò)于簡(jiǎn)單化，氯喹抗性發(fā)生的緩慢及復(fù)雜性也不支持單基因決定抗性的假設(shè)。2.2g1基因和g2基因早在90年代初，elles等20從一次遺傳雜交試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)瘧原蟲(chóng)抗氯喹表型以孟德?tīng)柗绞竭z傳，親代pfdr1基因不與子代藥物反響表型別離。對(duì)雜交子代進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)氯喹抗性表型與惡性瘧原蟲(chóng)7號(hào)染色體上約400kb的區(qū)域相關(guān)而不是5號(hào)染色體的pfdr1基因。這一區(qū)域包含80100個(gè)基因，對(duì)該區(qū)域進(jìn)展大量的分析研究后21，確定36kb的片段與氯喹抗性表型相關(guān)，并鑒定了2個(gè)候選基因：g1和g2。對(duì)采自東南亞和非洲大量的抗氯喹株檢

14、測(cè)結(jié)果說(shuō)明，g1尤其是g2基因多態(tài)性與氯喹抗性顯著相關(guān)，但不排除g1與g2協(xié)同參與了抗性。不過(guò)，對(duì)南美洲抗氯喹株的檢測(cè)沒(méi)有得到同樣結(jié)論。運(yùn)用免疫電鏡技術(shù)觀察到G2蛋白定位于原蟲(chóng)周?chē)号荨⑹澄锱菁澳遗輼?gòu)造形成的外膜復(fù)合物上，暗示G2可能是一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。然而檢索序列數(shù)據(jù)庫(kù)未發(fā)現(xiàn)G2與任何離子通道或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源。Sanhez等22認(rèn)為在氯喹抗性過(guò)程中，有轉(zhuǎn)運(yùn)分子在起作用，一個(gè)Na+/H+交換蛋白NHE可能調(diào)控著氯喹的攝齲已證實(shí)惡性瘧原蟲(chóng)以一種熱敏感的可飽和的方式主動(dòng)攝取氯喹，并可被高等真核生物NHE的特異性抑制劑氨氯吡咪競(jìng)爭(zhēng)性抑制。運(yùn)用與Su等同樣的親代子代克隆研究發(fā)現(xiàn)，氯喹抗性表型與惡性瘧原蟲(chóng)NHE的生理生化特征有遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)。因此，Sanhez等23推測(cè)惡性瘧原蟲(chóng)g2基因可能編碼Na+/H+交換蛋白，他們認(rèn)為兩者可能有共同的構(gòu)造和功能，比方氨氯吡咪結(jié)合位點(diǎn)、與NHE離子交換區(qū)同源等。但是，elles等24詳細(xì)分析了G2蛋白序列，不支持上述觀點(diǎn)。首先，盡管G2序列有一些疏水性氨基酸，卻沒(méi)有整合膜蛋白的典型特征，疏水性與跨膜區(qū)域分析說(shuō)明，NHE與G2有顯著差異。其次，G2與NHE離子交換區(qū)域不具有同源性，Sanhez等提出的G2有氨氯吡咪結(jié)合位點(diǎn)也沒(méi)有可靠的根據(jù)。此外，假如G2是一種整合膜Na