高分辨率溶解曲線

1、高分辨率溶解曲線第1頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四第2頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四內(nèi)容提示高分辨熔解曲線（High Resolution Melting）高分辨熔解曲線在遺傳育種中的應(yīng)用 篩查突變 （mutation scanning） 基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+內(nèi)標(biāo)法（ Small Amplicon Genotyping ） 非標(biāo)記探針法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析 檢測甲基化HRM儀器第3頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，

2、星期四第4頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四High Resolution DNA Melting（HRM)是基于有序列變化的Amplicon之間微弱的Tm值差異，通過DNA片段熔解曲線的差異進(jìn)行突變檢測，比如：第5頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四PCRTube 1Tube 2Tube 3Wild typeHomozygoteHeterozygoteLightScanner突變檢測原理第6頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四Lightscanner高分辨溶解曲線結(jié)果第7頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星

3、期四Saturating dyeLC Green plus 高分辨溶解曲線專用熒光染料第8頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四內(nèi)容提示高分辨熔解曲線（High Resolution Melting）的定義高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應(yīng)用 篩查突變 （mutation scanning） 基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+內(nèi)標(biāo)法（ Small Amplicon Genotyping ） 非標(biāo)記探針法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析 檢測甲基化HRM儀器第9頁，共46頁，2022年，5月20

4、日，17點(diǎn)17分，星期四Mutation Scanning未知SNP掃描第10頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四等對(duì)北京油雞CAPN1基因外顯子進(jìn)行掃描，篩查其潛在SNPs。第11頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四Bernhard J. HoWnger Hai-Chun Jing Kim E. Hammond-Kosack Kostya Kanyuka(Barley Application) Theor Appl Genet (2009) 119:851865DOI 10.1007/s00122-009-1094-2 數(shù)據(jù)來自英國洛桑農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)站B

5、ernhard等對(duì)Barley的eukaryotic translationinitiation factor 4E (eIF4E) gene基因外顯子進(jìn)行突變掃描結(jié)果第12頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四第13頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四內(nèi)容提示高分辨熔解曲線（High Resolution Melting）的定義高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應(yīng)用 篩查突變 （mutation scanning） 基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+內(nèi)標(biāo)法（ Small Amplicon Genotyping ） 非標(biāo)記探針法

6、（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析 檢測甲基化HRM儀器第14頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四Small Amplicon Genotyping擴(kuò)增小片段直接進(jìn)行基因型鑒定第15頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四使用已知Tm值的雙鏈DNA做溫度內(nèi)標(biāo)，低溫內(nèi)標(biāo)Tm(61) ,高溫內(nèi)標(biāo)Tm (92 )內(nèi)標(biāo)能夠?qū)崿F(xiàn)96/384孔板的溫度均一矯正。PCR片段的Tm值范圍： 70-88 優(yōu)點(diǎn)：不需要探針，直接利用PCR產(chǎn)物針對(duì)已知突變位點(diǎn)進(jìn)行基因分型第16頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)1

7、7分，星期四第17頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四第18頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四第19頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四為何要使用溫度內(nèi)標(biāo)第20頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四AT SNP without Calibration 72bp第21頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四Apply Temperature Calibration第22頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四AT SNP with Calibration第23頁，共46頁，

8、2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四Small Amplicon Genotyping等對(duì)北京油雞A-FABP基因進(jìn)行小片段法基因分型，擴(kuò)增片段為56bp，灰色曲線顯示的是雜合型（CT），藍(lán)顏色和紅顏色曲線分別代表純合型CC和TT。第24頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四內(nèi)容提示高分辨熔解曲線（High Resolution Melting）的定義高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應(yīng)用 篩查突變 （mutation scanning） 基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+內(nèi)標(biāo)法（ Small Amplicon Genotyping ） 非標(biāo)

9、記探針法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析 檢測甲基化HRM儀器第25頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四HRM Lunaprobe genotyping第26頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四HRM Lunaprobe genotyping第27頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四1 Probe 1 SNP, All Possible SNPs第28頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四1 Probe 1 SNP, All Possible SNPsC

10、lass 1 C:T, G:AClass 2 C:A, G:TClass 3 C:GClass 4 A:T第29頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四1 Probe, 2 SNPs, 1 Amplicon第30頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四2 Probes, 2 SNPs, 1 Amplicon- ApoE第31頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四2 Probes, 2 SNPs, 2 Amplicons - HFE第32頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四Amplicon Scanning 發(fā)現(xiàn)新的突

11、變第33頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四David De ，Yong Song at el.Application og high-resolution DNA melting for genotyping and variant scanning of diploid and autotetraploid potato Mol Breeding (2010) 25:6790 rrRRRrMix Rr:rr by 1:1 RrrrMix RR:Rr by 1:1 RRRr第34頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四內(nèi)容提示高分辨熔解曲線（High

12、Resolution Melting）的定義高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應(yīng)用 篩查突變 （mutation scanning） 基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+內(nèi)標(biāo)法（ Small Amplicon Genotyping ） 非標(biāo)記探針法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析 檢測甲基化HRM儀器第35頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四Rosario Muleo（2009）等用HRM方法對(duì)三個(gè)品種的SSR DCA4進(jìn)行分析，DCA4的等位基因有131bp的重復(fù)序列，雜合等位基因的序列為13

13、1-133bp，分析結(jié)果如圖8所示，HRM曲線可以將純合樣品和雜合樣品明顯的區(qū)分，其中一個(gè)等位基因只相差2bp。 三種顏色（淺灰，深灰、黑色）表明3種不同的品種。 Rosario Muleo等得出結(jié)論：HRM是一種快速、重復(fù)性高、成本低，操作簡單，且可以應(yīng)用于其他物種的SNP檢測及SSR基因分型的方法。Rosario Muleo,Marir Chiara Colao,Dario Miano at el. 2009 Genome52:252-260第36頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四內(nèi)容提示高分辨熔解曲線（High Resolution Melting）的定義高分辨熔

14、解曲線在蠶的遺傳育種中的應(yīng)用 篩查突變 （mutation scanning） 基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+內(nèi)標(biāo)法（ Small Amplicon Genotyping ） 非標(biāo)記探針法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析 檢測甲基化HRM儀器第37頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四第38頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四第39頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四第40頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四內(nèi)容提示高分辨熔

15、解曲線（High Resolution Melting）的定義高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應(yīng)用 篩查突變 （mutation scanning） 基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+內(nèi)標(biāo)法（ Small Amplicon Genotyping ） 非標(biāo)記探針法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析 檢測甲基化HRM儀器第41頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四2005LightScanner 96/38496/384 孔板8 分鐘/板2-6 秒/樣品溫度均一性： 0.15oC 數(shù)據(jù)采集速度：大于

16、100pts/秒 升溫速度： 0.1oC/秒2010LS32 32 樣品轉(zhuǎn)盤, 玻璃毛細(xì)管HRM 檢測 60 分鐘內(nèi)完成定量 PCR 和 HRM 檢測 HRM檢測升溫速度可以在 0.05 0.90oC/秒之間調(diào)節(jié)在升溫速度小于0.3/秒時(shí)，溫度均一性：0.05oC 數(shù)據(jù)采集速度：20pts/秒400pts/秒（與升溫速度有關(guān)） 0.3oC/秒 升溫速度= 67 pts/ 0.05oC/秒 升溫速度 = 400 pts/ 第42頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四LightScanner高分辨溶解曲線應(yīng)用LunaProbes非標(biāo)記探針基因分型未知SNP掃描Small Amplicon小片段基因分型第43頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四HRM分析流程在PCR反應(yīng)前加入 LCGreen 熒光染料時(shí)間大約2小時(shí)（包含試劑準(zhǔn)備）在LightScanner上進(jìn)行高分辨溶解曲線分析大約需要5-10 分鐘數(shù)據(jù)分析和處理大約需要5-10 分鐘PCR產(chǎn)物可以直接進(jìn)行下游的測序分析等（如需要）大約需要30-60分鐘第44頁，共46頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)17分，星期四LightScanner適于SNP分析速度、通量LightScanner 510分鐘完成96/384孔板的P