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1、T/CSMA XXXX2018 PAGE 2降香種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了降香(Dalbergia odorifera T.Chen)種子超低溫保存過(guò)程中的術(shù)語(yǔ)和定義、種子的選擇、種子前處理、種子保存量、種子冷凍方式、恢復(fù)培養(yǎng)等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于降香種子的超低溫長(zhǎng)期貯藏。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T 3543.6 農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 水分測(cè)定GB/T 3543.7 農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 其他項(xiàng)目檢驗(yàn)術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文
2、件。降香 Dalbergia odorifera T.Chen為豆科(Leguminosae)黃檀屬(Dalbergia Linn. f.)喬木,高1015 m,小枝有小而密集的皮孔,圓錐花序腋生,國(guó)家級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物。為XX特有的珍貴樹(shù)種,心材極耐腐,切面光,紋理美致,且香氣經(jīng)久不滅,是名貴家具、工藝品等上等木材;木材的蒸餾油香氣不易揮發(fā),可作定香劑;心材入藥,具有降壓、行氣活血、止痛止血的功效,是中國(guó)藥典(2015)收載的珍稀名XX藥。 降香果實(shí) Dalbergia odorifera T.Chen fruits果實(shí)為莢果,其莢果舌狀圓形,長(zhǎng)4.58 cm,寬1.51.8 cm,基部略被
3、毛,頂端鈍或急尖,基部驟然收窄與纖細(xì)的果頸相接,果頸長(zhǎng)510 mm,果瓣革質(zhì),有種子部分明顯隆起,狀如棋子,厚可達(dá)5 mm,有種子1(2)粒。降香種子 Dalbergia odorifera T.Chen seeds降香的播種材料為完整種子,貯藏特性判斷為頑拗性種子。種子圓腎形,扁平,棕褐色,直徑0.50.8 cm,表面光滑,種臍條形。種子超低溫保存 seed of cryopreservation 指將經(jīng)過(guò)前處理的降香種子置于液氮(-196)中保存。種子的選擇果實(shí)采收 11月至12月,當(dāng)莢果果皮由青綠色變?yōu)辄S褐色至棕褐色時(shí),即可采收,去除包裹種子的豆莢,取出種子。種子選擇挑選發(fā)育飽滿、均勻、
4、健康的種子,置于10 種子儲(chǔ)藏柜中保存?zhèn)溆茫ù娣艜r(shí)間不超過(guò)2個(gè)月)。種子前處理生活力檢測(cè)參照GB/T 3543.7中的2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)法檢測(cè)種子生活力。隨機(jī)抽取30 粒種子,水浸20 h,剝?nèi)ネ鈱臃N皮,沿種脊小心將種子分成2 爿后放培養(yǎng)皿內(nèi),內(nèi)側(cè)面向下,滴入TTC 溶液浸沒(méi)種子,室溫(25 )避光放置4 h 后觀察染色結(jié)果。生活力計(jì)算直接用肉眼對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行觀察鑒定。凡胚及胚乳全部染成有XX的鮮紅色,且組織狀態(tài)正常的,為有活力的種子;否則為無(wú)生活力的種子。計(jì)算:生活力=有活力的種子數(shù)/總的種子數(shù)100%待保存的降香種子生活力應(yīng)80%。含水量范圍用尼龍網(wǎng)袋包裹降香種子,置于
5、盛有變色硅膠的干燥器內(nèi),硅膠與種子的體積比為9000:1,室溫條件下干燥處理815 h,在干燥過(guò)程中定期測(cè)定種子含水量,將種子含水量由15%20%降至12%13%。參照GB/T 3543.6中的高恒溫烘干法(130烘干1h)測(cè)定種子含水量(W0),W0=(鮮重-絕干重)/鮮重100%。種子保存量降香種子保存量不少于300粒,以便后期的活力檢測(cè)使用。種子冷凍方式降香種子超低溫保存的冷凍方式為玻璃化冷凍法,即將裝有種子的5 mL凍存管(每管30粒種子)置于裝載液(LS)中并于25 處理種子25 min,再用玻璃化保護(hù)溶液(PVS2)冰浴處理種子30 min,換上預(yù)冷新鮮的PVS2后迅速投入液氮中進(jìn)
6、行超低溫保存?;謴?fù)培養(yǎng)種子解凍處理液氮中至少凍存24 h后,取出1個(gè)凍存管,立即放入40 水浴中快速解凍5 min,而后用洗滌液(DS)浸泡15 min,并用純凈水洗滌3次。凍后種子生活力檢測(cè)取出15粒解凍后的種子,參照5.15.2生活力檢測(cè)方法,進(jìn)行超低溫保存后的初始生活力檢測(cè)。當(dāng)種子生活力70%時(shí)視為保存成功。恢復(fù)培養(yǎng)將剩下15粒解凍后的降香種子,播種到帶有無(wú)菌濾紙的帶蓋發(fā)芽盒中,溫度25 28 ,濕度70% 85%條件下培養(yǎng)。降香種子出芽周期大概1030 d。附錄1 TTC的配制和保存方法精密稱(chēng)取TTC 1.00 g,溶于100 mL磷酸鹽緩沖液中,制成濃度為1%的TTC溶液,調(diào)pH至6
7、.57.5,置棕色瓶?jī)?nèi)4 冰箱備用。磷酸緩沖液配置方法:溶液I:9.08g磷酸二氫鉀溶于1 L無(wú)菌水中;溶液II:35.81 g磷酸二氫鈉溶于1 L無(wú)菌水中;I:II=2:3的比例混合制成磷酸鹽緩沖液)2 裝載液(LS)的配制及保存方法精密稱(chēng)取蔗糖13.7 g,稱(chēng)量甘油11.9 mL,溶于液體MS培養(yǎng)基中,調(diào)pH至5.8后定容至100 mL,高溫高壓滅菌,4 冷藏。 3 玻璃化溶液(PVS2)的配制及保存方法精密量取甘油23.8 mL、乙二醇13.6 mL、二甲亞砜13.6 mL,稱(chēng)取蔗糖13.7 g,溶于MS溶液中,調(diào)pH至5.8后定容至100 mL,高溫高壓滅菌,4 冷藏。注意:配置時(shí)需戴
8、手套,并在通風(fēng)廚內(nèi)操作。 4 洗滌液(DS)的配制及保存方法精密稱(chēng)取蔗糖41.1 g溶于MS溶液中,調(diào)pH至5.8后定容至100 mL,高溫高壓滅菌,4 冷藏。 參考文獻(xiàn)1 中國(guó)植物志委員會(huì).中國(guó)植物志(第40卷)M. 科學(xué)出版社.2004(1994):1142 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典M.XX,中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015,229-2303 Xu Langran. Chen Dezhao.Zhu Xiangyun et al. Fabaceae(Leguminosae) M /Flora Of China Beijing: Science Press/St. Louis: Missouri Botanical Garden Press. 2010. 10: 121-130.4 傅家瑞,宋松泉. 頑拗性種子生物學(xué)M. 中國(guó)科學(xué)文化出版社,2004:15 R
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