降香種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程

1、T/CSMA XXXX2018 PAGE 2降香種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了降香（Dalbergia odorifera T.Chen）種子超低溫保存過程中的術(shù)語和定義、種子的選擇、種子前處理、種子保存量、種子冷凍方式、恢復(fù)培養(yǎng)等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于降香種子的超低溫長(zhǎng)期貯藏。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 3543.6 農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 水分測(cè)定GB/T 3543.7 農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 其他項(xiàng)目檢驗(yàn)術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文

2、件。降香 Dalbergia odorifera T.Chen為豆科（Leguminosae）黃檀屬（Dalbergia Linn. f.）喬木，高1015 m，小枝有小而密集的皮孔，圓錐花序腋生，國(guó)家級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物。為XX特有的珍貴樹種，心材極耐腐，切面光，紋理美致，且香氣經(jīng)久不滅，是名貴家具、工藝品等上等木材；木材的蒸餾油香氣不易揮發(fā)，可作定香劑；心材入藥，具有降壓、行氣活血、止痛止血的功效，是中國(guó)藥典（2015）收載的珍稀名XX藥。 降香果實(shí) Dalbergia odorifera T.Chen fruits果實(shí)為莢果，其莢果舌狀圓形，長(zhǎng)4.58 cm，寬1.51.8 cm，基部略被

3、毛，頂端鈍或急尖，基部驟然收窄與纖細(xì)的果頸相接，果頸長(zhǎng)510 mm，果瓣革質(zhì)，有種子部分明顯隆起，狀如棋子，厚可達(dá)5 mm，有種子1（2）粒。降香種子 Dalbergia odorifera T.Chen seeds降香的播種材料為完整種子，貯藏特性判斷為頑拗性種子。種子圓腎形，扁平，棕褐色，直徑0.50.8 cm，表面光滑，種臍條形。種子超低溫保存 seed of cryopreservation 指將經(jīng)過前處理的降香種子置于液氮（-196）中保存。種子的選擇果實(shí)采收 11月至12月，當(dāng)莢果果皮由青綠色變?yōu)辄S褐色至棕褐色時(shí)，即可采收，去除包裹種子的豆莢，取出種子。種子選擇挑選發(fā)育飽滿、均勻、

4、健康的種子，置于10 種子儲(chǔ)藏柜中保存?zhèn)溆茫ù娣艜r(shí)間不超過2個(gè)月）。種子前處理生活力檢測(cè)參照GB/T 3543.7中的2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法檢測(cè)種子生活力。隨機(jī)抽取30 粒種子，水浸20 h，剝?nèi)ネ鈱臃N皮，沿種脊小心將種子分成2 爿后放培養(yǎng)皿內(nèi)，內(nèi)側(cè)面向下，滴入TTC 溶液浸沒種子，室溫（25 ）避光放置4 h 后觀察染色結(jié)果。生活力計(jì)算直接用肉眼對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行觀察鑒定。凡胚及胚乳全部染成有XX的鮮紅色，且組織狀態(tài)正常的，為有活力的種子；否則為無生活力的種子。計(jì)算：生活力=有活力的種子數(shù)/總的種子數(shù)100%待保存的降香種子生活力應(yīng)80%。含水量范圍用尼龍網(wǎng)袋包裹降香種子，置于

5、盛有變色硅膠的干燥器內(nèi)，硅膠與種子的體積比為9000:1，室溫條件下干燥處理815 h，在干燥過程中定期測(cè)定種子含水量，將種子含水量由15%20%降至12%13%。參照GB/T 3543.6中的高恒溫烘干法（130烘干1h）測(cè)定種子含水量（W0），W0=（鮮重-絕干重）/鮮重100%。種子保存量降香種子保存量不少于300粒，以便后期的活力檢測(cè)使用。種子冷凍方式降香種子超低溫保存的冷凍方式為玻璃化冷凍法，即將裝有種子的5 mL凍存管（每管30粒種子）置于裝載液（LS）中并于25 處理種子25 min，再用玻璃化保護(hù)溶液（PVS2）冰浴處理種子30 min，換上預(yù)冷新鮮的PVS2后迅速投入液氮中進(jìn)

6、行超低溫保存。恢復(fù)培養(yǎng)種子解凍處理液氮中至少凍存24 h后，取出1個(gè)凍存管，立即放入40 水浴中快速解凍5 min，而后用洗滌液（DS）浸泡15 min，并用純凈水洗滌3次。凍后種子生活力檢測(cè)取出15粒解凍后的種子，參照5.15.2生活力檢測(cè)方法，進(jìn)行超低溫保存后的初始生活力檢測(cè)。當(dāng)種子生活力70%時(shí)視為保存成功。恢復(fù)培養(yǎng)將剩下15粒解凍后的降香種子，播種到帶有無菌濾紙的帶蓋發(fā)芽盒中，溫度25 28 ，濕度70% 85%條件下培養(yǎng)。降香種子出芽周期大概1030 d。附錄1 TTC的配制和保存方法精密稱取TTC 1.00 g，溶于100 mL磷酸鹽緩沖液中，制成濃度為1%的TTC溶液，調(diào)pH至6

7、.57.5，置棕色瓶?jī)?nèi)4 冰箱備用。磷酸緩沖液配置方法：溶液I：9.08g磷酸二氫鉀溶于1 L無菌水中；溶液II：35.81 g磷酸二氫鈉溶于1 L無菌水中；I：II=2：3的比例混合制成磷酸鹽緩沖液）2 裝載液（LS）的配制及保存方法精密稱取蔗糖13.7 g，稱量甘油11.9 mL，溶于液體MS培養(yǎng)基中，調(diào)pH至5.8后定容至100 mL，高溫高壓滅菌，4 冷藏。 3 玻璃化溶液（PVS2）的配制及保存方法精密量取甘油23.8 mL、乙二醇13.6 mL、二甲亞砜13.6 mL，稱取蔗糖13.7 g，溶于MS溶液中，調(diào)pH至5.8后定容至100 mL，高溫高壓滅菌，4 冷藏。注意：配置時(shí)需戴

8、手套，并在通風(fēng)廚內(nèi)操作。 4 洗滌液（DS）的配制及保存方法精密稱取蔗糖41.1 g溶于MS溶液中，調(diào)pH至5.8后定容至100 mL，高溫高壓滅菌，4 冷藏。 參考文獻(xiàn)1 中國(guó)植物志委員會(huì).中國(guó)植物志（第40卷）M. 科學(xué)出版社.2004（1994）:1142 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典M.XX，中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015，229-2303 Xu Langran. Chen Dezhao.Zhu Xiangyun et al. Fabaceae（Leguminosae） M /Flora Of China Beijing: Science Press/St. Louis: Missouri Botanical Garden Press. 2010. 10: 121-130.4 傅家瑞，宋松泉. 頑拗性種子生物學(xué)M. 中國(guó)科學(xué)文化出版社，2004:15 R