常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)演示文稿

1、常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)演示文稿第一頁(yè)，共三十三頁(yè)。掌握： 1、PCR的基本操作方法。 2、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的基本原理和方法。理解： 1、PCR儀的使用方法。了解： 1、PCR體外擴(kuò)增的原理及其引物設(shè)計(jì)原則。 2、擴(kuò)增過(guò)程中各因素對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響。教學(xué)目的：第二頁(yè)，共三十三頁(yè)。1、PCR反應(yīng)體系的建立。2、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。教學(xué)重點(diǎn)：教學(xué)難點(diǎn)： 1、PCR反應(yīng)程序的設(shè)計(jì)方法。第三頁(yè)，共三十三頁(yè)。一、基本原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）：體外DNA酶促擴(kuò)增技術(shù)，能特異高效地在體外擴(kuò)增目的DNA片段。第四頁(yè)，共三十三頁(yè)。PCR反應(yīng)的基本步驟

2、變性94C雙鏈DNA模板被加熱變性成兩條單鏈退火4560 C（Tm-5C）寡聚核苷酸引物按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與單鏈模板DNA特異結(jié)合延伸72CDNA聚合酶作用下，以引物為起始，合成與模板DNA互補(bǔ)的新鏈第五頁(yè)，共三十三頁(yè)。Cycle 255 555Primer 15Primer 2Cycle 1 5 5Template DNAPCR技術(shù)的工作原理55 555 5 55第六頁(yè)，共三十三頁(yè)。Cycle 355 555 5 555 5 55 555 52530 次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。第七頁(yè)，共三十三頁(yè)。瓊脂糖凝膠電泳原理把DNA樣品加入到瓊脂糖凝膠的樣品孔中，并置于靜電場(chǎng)上

3、。由于DNA分子的雙螺旋骨架兩側(cè)帶有含負(fù)電荷的磷酸根殘基，因此在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，因而可依據(jù)DNA分子的大小來(lái)使其分離。在電泳前向凝膠或樣品中預(yù)加示蹤染料，電泳過(guò)程中染料同DNA結(jié)合，電泳后在紫外光照射下，可觀察到熒光，從而對(duì)分離的DNA進(jìn)行檢測(cè)。第八頁(yè)，共三十三頁(yè)。二、操作步驟第九頁(yè)，共三十三頁(yè)。模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶(如Taq酶)dNTPs反應(yīng)緩沖液（含Mg2+） PCR反應(yīng)的基本組分第十頁(yè)，共三十三頁(yè)。10PCR緩沖液（Mg2+Plus） 5ldNTP混合物（2.5 mM） 4l上游引物（10M） 2l下游引物（10M） 2

4、lDNA模板 4lTaq DNA聚合酶（2.5 U/l） 1l去離子水 32l實(shí)驗(yàn)步驟一：PCR反應(yīng)體系的建立（重點(diǎn)）50 l2345671加樣順序第十一頁(yè)，共三十三頁(yè)。PCR反應(yīng)程序的設(shè)計(jì)（難點(diǎn)） 預(yù)變性： 94 5 min 變性： 94 30 sec 退火： 55 30 sec 延伸： 72 40 sec(60 sec) 最終延伸： 72 5 min 保存： 4 for ever25cycles實(shí)驗(yàn)步驟二：PCR反應(yīng)程序的設(shè)計(jì)第十二頁(yè)，共三十三頁(yè)。PCR程序設(shè)計(jì)的主要因素循環(huán)溫度和時(shí)間Tm的概念： 在雙鏈DNA解鏈過(guò)程中，紫外吸光度的變化A260達(dá)到最大變化值的一般時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度。Tm計(jì)算

5、方法堿基數(shù)小于20： Tm=4(GC%)+2(AT%)堿基數(shù)大于20： Tm=81.5+0.41(GC%) (675/引物長(zhǎng)度)第十三頁(yè)，共三十三頁(yè)。主要實(shí)驗(yàn)儀器PCR儀第十四頁(yè)，共三十三頁(yè)。主要實(shí)驗(yàn)儀器PCR儀第十五頁(yè)，共三十三頁(yè)。實(shí)驗(yàn)步驟三：結(jié)果檢測(cè)瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物1. 試劑：50TAE電泳緩沖液：Tris 242 g，乙酸57.1 ml， 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）100 ml，定容至1 L，高壓滅菌后備用。1TAE電泳緩沖液：20 ml 50TAE電泳緩沖液加入雙蒸水，定容至1 L。2. 1瓊脂糖凝膠的配制： 100 ml TAE電泳緩沖液中加入1 g瓊脂糖，

6、搖勻后放入微波爐中，小火加熱幾分鐘至溶液透明位置，取出后冷卻至56左右時(shí)，加入微量（3.5 L）的EB（溴化乙錠），混勻后倒入槽中，冷卻后待用。第十六頁(yè)，共三十三頁(yè)。不同類型瓊脂糖分離DNA片段大小的范圍 瓊脂糖/標(biāo)準(zhǔn)高強(qiáng)度低熔點(diǎn)0.30.5700bp25kb0.8500bp15kb800bp10kb800bp10kb1.0250bp12kb400bp8kb400bp8kb1.2150bp6kb300bp7kb300bp7kb1.580bp4kb200bp4kb200bp4kb第十七頁(yè)，共三十三頁(yè)。3. 上樣反應(yīng)結(jié)束后取5L反應(yīng)產(chǎn)物，加入1L上樣緩沖液（6loading buffer），用1%

7、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 指示劑：溴酚藍(lán)Marker：DL2000。注意： 加樣孔位于負(fù)極，DNA由負(fù)極向正極泳動(dòng)4060第十八頁(yè)，共三十三頁(yè)。4. 電泳 電泳100 V，10 min左右。5. 觀察 凝膠成像系統(tǒng)或紫外燈下觀察結(jié)果 （手套拿取凝膠）第十九頁(yè)，共三十三頁(yè)。三、注意事項(xiàng) 1、注意移液槍的正確使用方法。 2、按順序逐一加入PCR反應(yīng)體系各組分，切勿遺漏。 3、取用各組分時(shí)，應(yīng)避免污染和貼槍頭壁損失。 4、按操作步驟正確設(shè)置使用PCR儀。 5、帶手套操作實(shí)驗(yàn)。第二十頁(yè)，共三十三頁(yè)。四、影響PCR反應(yīng)的因素1、模板 任何來(lái)源的各種構(gòu)型的含量極低的DNA樣品都可作PCR的模板。 輕微的污染都

8、會(huì)影響PCR的最終結(jié)果。2、脫氧核苷三磷酸（dNTPs） 4種dNTP在反應(yīng)中濃度應(yīng)相等，過(guò)高會(huì)抑制Taq酶活性，增加錯(cuò)配的幾率。 第二十一頁(yè)，共三十三頁(yè)。3、引物(引物的好壞是整個(gè)PCR反應(yīng)的關(guān)鍵) 引物濃度一般為0.10.5mmol/L，濃度太高，會(huì)增加非特異性擴(kuò)增，形成引物二聚體；濃度太低，影響擴(kuò)增效率和產(chǎn)率。*引物設(shè)計(jì)的原則長(zhǎng)度15 30bpGC含量45 55%兩條引物退火溫度一致或接近，Tm差值小于5無(wú)連續(xù)核苷酸引物內(nèi)部及引物間無(wú)互補(bǔ)，以免形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物二聚體第二十二頁(yè)，共三十三頁(yè)。特異性的引物：特異性的產(chǎn)物第二十三頁(yè)，共三十三頁(yè)。4、Mg2+濃度Mg2+是DNA聚合酶發(fā)揮作用的

9、必須成分；最適濃度一般為0.5-2.5mmol/L,濃度過(guò)低則無(wú)法啟動(dòng)反應(yīng)，過(guò)高則影響產(chǎn)物特異性。 第二十四頁(yè)，共三十三頁(yè)。5、Taq DNA聚合酶 具有53DNA聚合活性外，還具有53DNA外切活性。因此，在某些時(shí)候可選擇具有校讀活性的聚合酶例如Pfu；可以根據(jù)需要選擇擴(kuò)增長(zhǎng)片段的Taq酶，高速擴(kuò)增的Taq酶等 反應(yīng)終濃度以22.5 U/100l為最佳 第二十五頁(yè)，共三十三頁(yè)。五、問(wèn)題分析第二十六頁(yè)，共三十三頁(yè)。問(wèn)題1：無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物現(xiàn)象：正對(duì)照有條帶，而樣品則無(wú)M樣品A樣品B正對(duì)照第二十七頁(yè)，共三十三頁(yè)。純度：含有抑制物濃度：含量低質(zhì)量：全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)：二級(jí)結(jié)構(gòu) 原因?qū)Σ呒兓０寤蛘呤褂脙?yōu)質(zhì)試劑盒提

10、取模板DNA加大模板的用量用好的反轉(zhuǎn)錄酶用溫度高的反轉(zhuǎn)錄酶(1)無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物之模板原因第二十八頁(yè)，共三十三頁(yè)。引物錯(cuò)誤引物設(shè)計(jì)不好引物降解引物合成、純化不好 原因?qū)Σ吆铣汕皺z查評(píng)價(jià)、重新設(shè)計(jì)引物換一管新引物免費(fèi)重新合成(2)無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物之引物原因第二十九頁(yè)，共三十三頁(yè)。退火溫度延伸時(shí)間循環(huán)次數(shù) 原因?qū)Σ哌f度PCR聚合酶的延伸速度適當(dāng)增加循環(huán)數(shù)(3)無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物之PCR條件原因第三十頁(yè)，共三十三頁(yè)。 現(xiàn)象：條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致或者非特異性擴(kuò)增帶問(wèn)題2：非特異性擴(kuò)增 M 1 2第三十一頁(yè)，共三十三頁(yè)。引物特異性差模板或引物濃度過(guò)高酶量過(guò)多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過(guò)多 原因?qū)Σ咧匦略O(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)減少酶量降低鎂離子濃