20160831 畢赤酵母蛋白不表達的原因

1、畢赤酵母蛋白不表達的原因很多朋友問這樣一個問題：為什么畢赤酵母不表達?他們自己也很納悶，重組酵母PCR檢測也證明目的基因重組了，但是誘導之后就 是在表達上清中檢測不到目的蛋白，仔細研究操作手冊后仍然不知道原因。本人，根據(jù)自己的經驗，采用倒推的方法，按實驗過程從后向前分析，供大家參考：1、誘導之后表達上清中檢測不到目的蛋白：檢測的方法是否有問題，要考慮是不是蛋白表達量低而沒有檢測到？如果是蛋白表達低，可以選擇濃縮蛋白，具體的方法很多，有TCA、丙酮、濃縮柱 等等方法，之前在本版已經發(fā)過帖，在此不贅述。：如果蛋白濃縮N倍之后仍然檢測不到，那基本可以確證蛋白并不在上清中。那 么蛋白到哪里去了，考慮是

2、否沒有分泌出來，而是在胞內，那就需要通過裂解酵母來檢 測胞內蛋白，具體的方法很多，在此也不贅述，曾整理過相關破碎的帖子。：如果胞內也沒有目的蛋白表達，那么基本可以確定蛋白并沒有表達。2、為什么沒有表達呢?倒推回來就是誘導的過程了，誘導體系是什么?甲醇 濃度是多少?培養(yǎng)問題是多少，轉速是多少?這些都要注意。甲醇一般是0.5%-1.0%，本人用的是0.5%，也有很多人也用1.0%， 曾見過一個帖子，說超過 1.5%反而會抑制表達，沒有驗證過，供大家參考。培養(yǎng)問題 28-30 度比較合適，轉速 250rpm 比較合適，誘導體系沒有固定的體系，說明書上推薦的是BMGY到OD600 26,換到BMMY

3、中 OD600 為 1 左右。3、如果誘導的過程也沒有問題，那問題就復雜了，特別是重組酵母 PCR 檢測證明目的基因確實已經發(fā)生了重組。這個時候是最郁悶的了，但是郁悶怎么辦，還是要找原因，在此我給的建議是先做 RT-PCR 證明 mRNA 水平的情況，也就是說有沒有轉錄。如果轉錄了，后續(xù)的操作也 沒有問題（本帖的 1、 2 項），那么只有重新設計實驗，比如換酵母株，有文章上說：用 GS115表達不出蛋白，換KM71H后，大部分克隆能表達。4、關于畢赤酵母不表達的。有個帖子說的很好，在此和大家分享一下。1、菌株：用GS115表達不出蛋白，換KM71H后，大部分克隆能表達。2、溫度： 在 28 度

4、和室溫下誘導表達，表達水平可能都不低。3、pH：手冊上用6.0, pH提高到6.8,不表達的蛋白可能就表達出來。BMMY的 PH7.0-7.5比較合適。國內外做的最好的rHSA，最適pH大概5-6左右。pH3的時候 yeast 和 peptone 好像會沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氫鉀調，具體比例自己去試試。4、偏愛密碼子：codon bias 般不是主要的問題，你要表達的蛋白特性才是主要 問題，酵母對分子量大（30KD以上），結構復雜（如一些蛋白酶），二硫鍵含量多的蛋白往 往不能有效表達，尤其是分泌表達。密碼子改造對一些較小的而且結構簡單的蛋白表達 量的提高可能有一些作用。比如一位戰(zhàn)友用Pic

5、hia酵母表達一個單鏈抗體，29KD，含 有2對二硫鍵，表達量約幾毫克每升，選用酵母偏好密碼子全基因合成后，表達量沒有 什么提高。5、表達時間與空質粒轉化對照：誘導時間長了以后，是會有很多蛋白分泌出來的， 時間越長雜蛋白就越多，且分子量都比較大。最好做一個空質粒轉化的對照，這樣就會 比較肯定到底是不是自身的蛋白分泌的結果。6、污染：每個樣品從G418板上挑10個左右單克隆于2ml BMGY搖菌（30ml玻璃 管，比LB管大一點），紗布一般用8層，一天左右看著比較渾離心，留樣1ml，余1ml 換2ml BMMY誘導表達，3,4層紗布足夠了。污染一般都是跟瓶口覆蓋有關的原因造成的，只蓋紗布肯定會污

6、染。加蓋報紙后， 就再沒遇到過污染。如果只用6層紗布，污染的可能當然很大，100ml三角瓶，裝量 10ml培養(yǎng)液，用橡筋把8層紗布和2層報紙拴緊封口，空氣浴搖床。7、不表達：蛋白有沒有表達就要看你的運氣了，一般重復2-3次實驗都沒有表達 菌株，這個蛋白就放棄表達了。8、表達量：30KD,10mg/L表達量已經很高，最直接的方法是發(fā)酵，一般提高5-10 倍。大腸桿菌一樣出現(xiàn)大團的超表達蛋白。9、糖基化：酵母分泌表達的N糖基化是可以預測的，有如下序列：N X S/T就是 潛在的糖基化位點，X為任意氨基酸，1個糖基化位點會加上1-3KD左右的糖基。另外 可能還有O糖基化話，但是無法預測其位點，不過很

7、少聽說表達蛋白有O糖基化的。 如果胞內表達，不存在糖基化的問題。10、表型與表達：重組Sall和Bglll酶切產生單交換和雙交換，結果就是產生Mut+ 和 Muts 表型的菌株;前者在甲醇誘導表達時生長快，消耗的甲醇多，后者生長慢，消耗 的甲醇少，所以誘導表達時Muts表型要求更高的菌體濃度。一般用Mut+表型的較多， 但是對某些蛋白Muts菌株可能表達的更好，只有試試才知道你的蛋白用那種菌株表達 較好。11、培養(yǎng)基YPD：最基本的培養(yǎng)用;BMGY：誘導表達前培養(yǎng)用;BMMY：誘導表達用;MD：電 轉化后篩選his+用。YEPD 是不能代替 BMGY 的，因為有葡萄糖，這樣殘留的葡萄糖會影響下

8、一步的 誘導表達。不過有一種方法是可行的，就是用YPG培養(yǎng)基代替，只是把YEPD中的葡 萄糖用3%的甘油代替，也可以降低成本。搖瓶畢竟不能和發(fā)酵罐比，甘油殘余會抑制 甲醇利用。BMGY、BMMY滅菌后才能加甲醇、磷酸鉀、生物素。配制BMMY時也沒必要用 5%過濾除菌的甲醇，在滅菌后使用前加 100%甲醇至你要的濃度。YNB可以高壓滅菌，沒問題的，也可以0.22um過濾處理，天冬氨酸和蘇氨酸要待 培養(yǎng)基高壓滅菌后加入配YPD時可以加入YPD 一起滅菌，但時間不能太長，溫度不 能太高，一般121-125度12-15分鐘足夠了。若時間過長，溫度過高，可能導致YPD 焦化。 glucose 和含氮化合物在一起容易產生美拉德反應，這是配制培養(yǎng)基中的禁忌。 顏色很深的話，基本不能使用了?；蛘吆衅咸烟呛?或 YNB 的培養(yǎng)基 108度 35min 高壓滅菌。小量發(fā)酵其實可以把培養(yǎng)基成分