液相色譜柱的分類和保護(hù)

1、液相色譜柱的分類和保護(hù)一、色譜柱大體知識色譜是一種分離分析手腕，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。 對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各類微粒填料 好多孔硅膠和以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球（包括離子互換樹脂）、多 孔碳等，其粒度一般為3,5, 7, 10um等，柱效理論值可達(dá)516萬/米。對于一般的分析 只需5000塔板數(shù)的柱效；對于同系物分析，只要500即可；對于較難的分離物質(zhì)對則可采 用高達(dá)2萬的柱子，因此一般1030cm左右的柱長就可以知足復(fù)雜混合物分析的需要。柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達(dá)到最佳效率，除柱外死體積

2、要小外，也要有合理 的柱結(jié)構(gòu)（盡可能減少填充床之外的死體積）及裝填技術(shù)。即便最好的裝填技術(shù)，在柱中心 部位和沿管壁部位的填充情形老是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速 較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi) 算起30倍料徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對柱效的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效 應(yīng)。1柱的構(gòu)造色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)X篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不 銹鋼制成，壓力不高于70Kg/cm2時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的 光潔度。為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多通過拋光。也有人在不銹鋼柱內(nèi)

3、壁涂 敷氟塑料以提高內(nèi)壁的光潔度，其效果與拋光相同還有利用熔融硅或玻璃襯里的，用于細(xì)管 柱。色譜柱兩頭的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，孔徑（5-10 um）,取決于填料 粒度,目的是避免填料漏出，柱內(nèi)徑一般是按照柱長、填料粒徑和折合流速來肯定，目的是 為了避免管壁效應(yīng)。柱的進(jìn)展方向因強調(diào)分析速度而進(jìn)展出短柱，柱長310cm，填料粒徑23um。為提高分析靈敏度， 與質(zhì)譜（MS）聯(lián)接，而進(jìn)展出窄徑柱、毛細(xì)管柱和內(nèi)徑小于的微徑柱MICROBORE）。細(xì) 管徑柱的長處是：節(jié)省流動相；靈敏度增加；樣品量少；能利用長柱達(dá)到高分離度； 容易控制柱溫；易于實現(xiàn)LC-MS聯(lián)用。但由于柱體積愈來愈小，柱

4、外效應(yīng)的影響就加倍顯著，需要更小池體積的檢測器（乃至 采用柱上檢測），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套利用的設(shè)備應(yīng)具有如下性能：輸液 泵能精密輸出1100ul/min的低流量，進(jìn)樣閥能準(zhǔn)確、重復(fù)地進(jìn)樣微小體積的樣品。且因 進(jìn)樣量小，要求高靈敏度檢測器，電化學(xué)檢測幫質(zhì)譜儀在這方面具有突出長處。3柱的填充色譜柱的性能除與固定相性能有關(guān)外，還與填充技術(shù)有關(guān)。在正常條件下，填料粒度20um時，干法填充制備柱較為適合；顆粒20um時，濕法填充較為理想。填充方式一 般有四種：高壓勻漿法，多有效于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；徑向加壓法,Waters 專利；軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；干法，柱填充的技

5、術(shù)性強，大多數(shù)實驗室 利用己填充好的商品柱。必需指出，高效液相色譜柱的取得，裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié)，但根本問題還在于填料本身 性能的好壞，和配套的色譜儀系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)是不是合理。二、液相色譜柱規(guī)格色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類常規(guī)分析柱（常量柱），內(nèi)徑25mm,柱長1030cm；窄徑柱（narrow bore），內(nèi)徑 1 2mm，柱長 1020cm；毛細(xì)管柱（又稱微柱microcolumn），內(nèi)徑；半制備柱，內(nèi)徑5mm；實驗室制備柱，內(nèi)徑2040mm，柱長1030cm；生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。色譜柱了解1）平均顆粒度，顆粒度散布顆粒度（dp）越?。褐г礁撸▊髻|(zhì)好，渦流擴散小）柱壓越高 （滲

6、透性差）顆粒散布顆粒散布越寬：柱效低（滲透性差）顆粒形狀球型：柱效高、重現(xiàn)性好、柱床結(jié)構(gòu)均勻無定型：柱床結(jié)構(gòu)不均勻流動相線性速度不均勻，譜帶擴展2）鍵合相化學(xué)影響化合物的分離度：不同鍵合相對不同種類的化合物分離不同a可能致使色譜的分離機理不同3.如：C18、C8、CN3）含碳量含碳量越高，k值越大（固定相傳質(zhì)效應(yīng)增加）高含碳量有利于不易保留的化合物的分離水解穩(wěn)固性好，重現(xiàn)性好有利于極性化合物的拖尾改善低含碳量有利于分析中性及堿性化合物降低溶劑損耗填料的端基封口k蒞k蒞（50/50的乙睛/水）增加碳含量（ - 1%）碳量如下所示:,312.512.411.312.07.95 5Symmetry減

7、少不可逆吸附或拖尾I由蜘睥不同色譜柱 LiChrosorb RP-1812121212111110Resolve C-18Ultra叩阮re ODSPartisil ODS-3pBondpak C-18Nova-Pak C-184）填料的端基封口封口殘余硅羥基減少不可逆吸附或拖尾增加碳含量（ -1%）5）硅膠的活性主要影響堿性化合物的保留行為：k，生產(chǎn)硅膠時處置溫度不同，硅膠 活性也不同，是選擇性不同的主要來源，硅膠的雜質(zhì)含量，重金屬含量低，硅羥基活性小， 拖尾減小，是色譜柱質(zhì)量好壞的重要標(biāo)志，填料的穩(wěn)固性，硅膠填料，pH: 2-8,聚合物填 料，pH: 2-12, pH值小于2時，鍵合相水解

8、，液相色譜法可否將某一樣品完全分離，主要 取決于色譜柱的選擇性和柱效，這在專門大程度上取決于固定相的選擇是不是適當(dāng)。6）色譜柱的規(guī)格：內(nèi)徑檢測的靈敏度、樣品的容量長度 分離度，理論塔板數(shù)速度樣品的容量檢測的靈敏度7）柱性能評價：購買的色譜柱，利用前都要對其性能進(jìn)行考察，利用期間或放置一段 時刻后也要從頭檢查。柱性能指標(biāo)包括在必然實驗條件下（樣品、流動相、流速、溫度）下 的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性，或分離度。 一般說來容量因子和選擇性因子的重復(fù)性在5%或10%之內(nèi)。進(jìn)行柱效比較時，還要注 意柱外效應(yīng)是不是有轉(zhuǎn)變。一份合格的色譜柱評價報告應(yīng)給出柱的大體參數(shù)

9、，如柱長、內(nèi)徑、填料的種類、粒度、 色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。色譜柱的利用和保護(hù)注意事項色譜柱的正確利用和保護(hù)十分重要，稍有不慎就會降低柱效，縮短利用壽命乃至損壞. 在色譜操作進(jìn)程中，需要注意下列問題，以保護(hù)色譜柱.避免壓力和溫度的急劇轉(zhuǎn)變及任何機械震動.溫度的突然轉(zhuǎn)變或使色譜柱從高處掉下 都會影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時應(yīng)該 緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時的轉(zhuǎn)動不能過緩（如前所述）.應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，專門是反相色譜中，不該直接從有機溶劑改變成全數(shù)是水， 反之亦然.一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱能夠反沖時，才能夠反沖除去柱內(nèi)的 雜質(zhì).不

10、然反沖會迅速降低柱效.選擇利用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞.有時能夠在進(jìn)樣器前面 連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠，預(yù)柱為硅膠，可使流動相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠 飽和，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解.避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱骨需要對樣品進(jìn)行預(yù)處置或在進(jìn) 樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱.保護(hù)柱一般是填有固定相的短柱.保護(hù)柱能夠而且應(yīng)該常 常改換.經(jīng)常常利用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)，在進(jìn)行清洗時，對流路系統(tǒng) 中流動相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右， 即常規(guī)分析需要50-75ml。下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順

11、序，作為參考：正相硅膠柱以正已烷（或庚烷）二氯甲烷（或氯仿）和甲醇依次沖洗，然后再以相反 順序依次沖洗，所有溶劑都必需嚴(yán)格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質(zhì)，已烷使 硅膠表 面從頭活化。反相柱以水、甲醇、乙臘、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。若 是下一步分析用的流動相不含緩沖液，那么能夠省略最后一步用水沖洗。一氯甲烷能洗支 殘留的非極性雜質(zhì)。四氫呋喃與乙臘或甲醇的混全溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞砜數(shù) 次。另外，用乙臘、丙酮和三氟醋酸（%）梯度洗能除去蛋白質(zhì)污染。陽離子互換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子互換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去互換性能強的鹽，然后用水、甲醇、水依次沖洗。保

12、留色譜柱時應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙臘或甲醇，柱接頭要擰緊，避免溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁 止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置留宿或更長時刻。色譜柱利用進(jìn)程中，若是壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時應(yīng)改換濾片或 將其掏出進(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染；若是柱效降低或色譜峰 變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。通常色譜柱壽命在正確使歷時可達(dá)2年以上。以硅膠為基質(zhì)的填料，只能在pH29范 圍內(nèi)利用。柱子利用一段時刻后，可能有一些吸附作用強的物質(zhì)保留于柱頂。新的色譜柱在 利用一段時刻后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降。每次工作完后，最好用洗脫能力強 的洗脫液沖洗，例如 ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當(dāng)

13、采用鹽緩沖溶液作流動 相時，利用完后應(yīng)用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、漠）的化合物可能 會侵蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不常常利用，應(yīng)每隔45天開機沖洗15分鐘。9柱的保養(yǎng)：當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時，閥件或管路必然要清洗干凈；要注意流動相的脫氣；避免利用高粘度的溶劑作為流動相；進(jìn)樣樣品要提純；嚴(yán)格控制進(jìn)樣量；天天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品；天天分析測定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗?；若分析柱長期不利用，應(yīng)用適當(dāng)有機溶劑保留并封鎖；四、正相色譜法與反相色譜法比較表四、正相色譜法與反相色譜法比較表反相色譜法反相色譜法中低正相色譜法固定相極性高中固定相極性

14、低中低中極性小先洗出中高極性大先洗組分洗脫順序 出從上表可看出，當(dāng)極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界限（如 氨基鍵合固定相）。五、1.色譜柱的利用說明1）、色譜柱利用前注意事項：色譜柱的貯存液無特殊說明，均為評價報告所示的流動相。在利用前，必然要注意色譜 柱的貯存液與要分析樣品的流動相是不是互溶。在反相色譜中，如用高濃度的鹽或緩沖液作 洗脫劑，應(yīng)先用10%左右的低濃度的有機相洗脫劑過渡一下，不然緩沖液中的鹽在高濃度 的有機相中很容易析出，堵塞色譜柱。2）、流動相：流動相中所利用的各類有機溶劑要盡可能利用色譜純，配流動相的水最好是超純水或全 玻璃器皿的雙蒸水。若是將所配得流動相再通過

15、Rm的濾膜過濾一次則更好，尤其是含鹽的 流動相。另外，裝流動相的容器和色譜系統(tǒng)中的在線過濾器等裝置應(yīng)該按期清洗或改換。以常規(guī)硅膠為基質(zhì)的鍵合相填料通常的pH值適用范圍是，BDS C18適合于堿性化合物， pH值適用范圍為。當(dāng)必需要在pH值適用范圍的邊界條件下利用色譜柱時，每次利用結(jié)束 后當(dāng)即用適合于色譜柱貯存并與所利用的流動彼此溶的溶劑清洗，并完全置換掉原來所利用 的流動相。3）、樣品：樣品也要盡可能清潔，可選用樣品過濾器或樣品預(yù)處置柱（SPE）對樣品進(jìn)行預(yù)處置； 若樣品不便處置，要利用保護(hù)柱。在用正相色譜法分析樣品時，所有的溶劑和樣品應(yīng)嚴(yán)格脫 水。2、色譜柱的保留1）、反相色譜柱天天實驗后的

16、保養(yǎng)：利用緩沖液或含鹽的流動相，實驗完成后應(yīng)用10%的甲醇/水沖洗30分鐘，洗掉色譜柱 中的鹽，再用甲醇沖洗30分鐘。注意：不能用純水沖洗柱子，應(yīng)該在水中加入10%的甲醇， 避免將填料沖塌陷。2）、長期保留色譜柱：如色譜柱要長時刻保留，必需存于適合的溶劑下。對于反相柱能夠貯存于純甲醇或乙臘 中，正相柱能夠貯存于嚴(yán)格脫水后的純正己烷中，離子互換柱能夠貯存于水（含防腐劑疊氮 化鈉或柳硫汞）中，并將購買新色譜柱時附送的堵頭堵上。貯存的溫度最好是室溫。3、色譜柱的再生因為色譜柱是消耗品，隨著使歷時刻或進(jìn)樣次數(shù)的增加，會出現(xiàn)色譜峰高降低，峰寬加 大或出現(xiàn)肩峰的現(xiàn)象，一般來講可能是柱效下降。1）、反相柱的

17、再生：依次采用20-30倍的色譜柱體積的甲醇：水=10： 90 （V/V），乙 臘，異丙醇作為流動相沖洗色譜柱，完成后再以相反順序沖洗色譜柱。2）正相柱的再生：依次以20-30倍色譜柱的體積的正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇 作為流動相沖洗色譜柱，然后再以相反的順序沖洗色譜柱。要注意上述溶劑必需嚴(yán)格脫水。4、色譜柱在利用進(jìn)程中易出現(xiàn)的問題和解決辦法色譜柱在利用中最多見的問題就是柱壓升高，若是柱壓是在長時刻利用進(jìn)程中緩慢增 加，屬于正?，F(xiàn)象。但柱壓在利用進(jìn)程中突然升高（系統(tǒng)管路堵塞及壓力傳感器故障除外）， 可能的原因有如下幾點：1）、色譜柱頭的過濾篩板堵塞或污染；2）色譜柱頭的填料被樣品污染；3）色譜柱內(nèi)緩沖液中的鹽碰到高