液相色譜分析方法的建立

1、方法建立的步驟開始前應(yīng)知道1.樣品的性質(zhì)在開始方法建立之前，我們應(yīng)該檢查自己對樣品的了解程度， 并明確分離目標。表1有關(guān)樣品組分和性質(zhì)的重要信息所含化合物的數(shù)目化合物的化學結(jié)構(gòu)官能團）化合物的分子量化合物的pKa值化合物的UV光譜圖化合物在樣品中的濃度范圍樣品的溶解度樣品的化學成分能夠為選擇HPLC分離的最佳初始條件提供有價 值的線索根據(jù)已知的樣品信息，HPLC方法建立有兩種不甚相同的模 式。一種模式依據(jù)樣品的“化學性質(zhì)”選擇最佳初始條件，色譜工 作者需很大程度依賴于過去的經(jīng)驗 如類似結(jié)構(gòu)化合物的分離）和/ 或用文獻資料補充現(xiàn)有信息而另一種模式則直接開始色譜分離，而 對樣品的性質(zhì)不大注意這兩種

2、HPLC的方法建立模式可分別稱為理淪 型與經(jīng)驗型初始分離一旦開始，可以根據(jù)類似的思路理論的與經(jīng)驗 的）選擇進一步的實驗。b5E2RGbCAP2.分離的目的HPLC分離的目的必須十分明確，下面的問題在建立方法之初就 應(yīng)確定：1）主要目的是什么？定量或定性，還是定性、定量同時做？；2）是否有必要解讀出樣品的所有成分？譬如可能有必要分離出產(chǎn)品中 的所有降解物或雜質(zhì)，以使含量測定結(jié)果更加可靠，但卻沒必要將 它們彼此完全分開。plEanqFDPw3）如要求定量分析，準確度與精密度需多大？樣品主要成分的精密度 通常能達到12%，特別是不需樣品預處理的情況。DXDiTa9E3d4）特殊化合物可能會以不同的樣

3、品形式出現(xiàn) 如：原料藥，一種或多 種形態(tài)，環(huán)保樣品等）。是否需要一種以上的HPLC方法？單一方 法分離不同形態(tài)樣品是否理想？ RTCrpUDGiT5）一次將分析多少樣品？當必須同時處理大量樣品時，運行時間將變 得非常重要。有時甚至為了縮短運行時間而以犧牲樣品分離度作代 價，如縮短柱長或加快流速。當一次分析的樣品數(shù)目超過10個， 運行時間一般應(yīng)控制在20min以內(nèi)。5PCzVD7HxA6）將要使用該方法的實驗室中，有哪些HPLC設(shè)備？色譜柱能否恒溫 系統(tǒng)能否做梯度洗脫？該方法是否可在不同設(shè)計與生產(chǎn)的設(shè)備上運 行？ jLBHrnAILg方法建立實驗開始之前，應(yīng)明確對方法的這些要求。樣品的預處理和檢

4、測1.預處理：樣品來源形式不同，可能以如下形式出現(xiàn):1.預處理：樣品來源形式不同，可能以如下形式出現(xiàn):1） 可直接進樣的溶液；：2 ）需稀釋、pH緩沖、加人內(nèi)標或其它定容操作的溶液；3） 必須首先溶解或提取處理的固體；。檢測器，因這種檢測器使用方便，且可用于大多 數(shù)樣品。UV光譜數(shù)據(jù)可從文獻中查找，也可通過所測樣品成分的化 學結(jié)構(gòu)估算，直接測得如果可拿到化合物純品）或在HPLC分離期 間用二極管陣列檢測器，或衍生化樣品使檢測 信號增強。LDAYtRyKfE建立分離方法選擇HPLC分離模式與起始條件首先，我們要確定使用什么方法最合適；如果我們選定HPLC分 離模式，將樣品分為一般樣品或特殊樣品。

5、一般樣品為小分子典型 混合物，用近乎標準化的起始條件即可分開。而樣品特殊需用特殊 的色譜柱和特定的條件才能很好地分離。Zzz6ZB2Ltk一般樣品可進一步分為中性或離子樣品。離子樣品包括酸、堿、兩性化合物和有機鹽類（電離的強酸或強堿 。如樣品為中性， 一般不需在流動相中加緩沖液或添加劑，但對于酸或堿性樣品，通 常需在流動相中加入緩沖劑。堿性或陽離子樣品，推薦用“弱酸 性”的反相色譜柱，流動相中加人胺添加劑可能對分離有利。首次 實驗完成后，再按照結(jié)果系統(tǒng)地加以進一步完善。dvzfvkwMIl樣品的性質(zhì)HPLCGCCESECTLC11般樣品特殊樣品S.中性的離子無機離子異構(gòu)體對映體生物樣品等度糖類

6、異構(gòu)體對映體生物樣品等度糖類梯度蛋白質(zhì)大分子離子正 相合成聚合物圖1.利用樣品的有關(guān)條件，選擇初始實驗分離條件表2特殊樣品的處理樣品要求無機離 子檢測為主要問題；使用離子色譜異構(gòu)體有些異構(gòu)體能用反相HPLC分開，可分為一般樣品類中；用 （I正相HPLC或（2環(huán)糊精 硅膠色譜柱的反相分離能較好 地分離異構(gòu)體對映體分離這些化合物需要“手性”條件生物樣多種因素如分子構(gòu)象，極性官能團和寬范圍的疏水性使這品種樣品很特殊大分子“大”分子需要大孔徑的色譜柱填料（N10.m孔徑表3 首次HPLC分離的較好實驗條件分離條件較好的首要選擇色譜柱尺寸（長度，內(nèi)徑ID粒度固定相15x4.6cn5uma.C8 或 C1

7、8流動相溶劑A和B緩沖液一乙睛%B80100%b.緩沖液（化合物、pH、濃 度25mM 磷酸鉀，2.0pH3.0c.添加劑（如胺改性劑、離子 對試劑開始時不用樣品大小體積V25ul重量 d. 時，僅需要分離出個別除莠劑，確定其特征保留時間進行峰鑒別即 可。6ewMyirQFL盡管大多數(shù)HPLC設(shè)備能在更高的壓力下工作，使用新色譜柱的 工作壓力不應(yīng)超過170bar2500psi , 17MPa），壓力上限最好在 2000psi 以下。kavU42VRUs限制該壓力基于兩點原因：第一.隨著色譜柱的使用，微粒雜 質(zhì)會逐步堵塞柱頭，使柱壓成倍升高；第二.較低的壓力 170bar）適于泵、進樣閥、尤其是

8、自動進樣裝置的穩(wěn)定工作， 密封墊的壽命更長，色譜柱堵塞的情況減少，系統(tǒng)的耐久性明顯提 高。因此，最好以小于泵的最大允許壓力的50%作為目標壓力。y6v3ALoS89可重現(xiàn)的分離在進行實驗時，要能夠重現(xiàn)每次實驗色譜圖。在方法建立過程 中改變實驗條件流動相、色譜柱、溫度）時，必須經(jīng)過足夠長的時 間使色譜柱在新流動相和溫度下達到平衡。通常以1020倍柱體積 的新流動相沖洗色譜柱后，色譜柱可達到平衡。M2ub6vSTnP五.HPLC方法的完善最后的實驗方案應(yīng)達到方法建立開始時所設(shè)定的所有目標。方 法本身在日常工作中應(yīng)經(jīng)受住考驗，應(yīng)適用于所有的相關(guān)實驗室以 及人員。0YujCfmUCw定量與方法論證一旦

9、完成了 HPLC方法建立，應(yīng)對其進行論證，進行全面論證通 常需通過簡略核查方法的專屬性、線性、準確性、精密度、回收 率、靈敏度等而實施。在最終論證方法之前，應(yīng)準備和檢查書面分 析方案，使之清晰、嚴密。實際的論證程序按方法的重要性不同， 需時為1天一 2周不等。理想的情況是，通過方法論證能找出可能 因儀器和操作者的不同而導致的潛在問題。eUts8ZQVRd在日常HPLC分析中，柱間重現(xiàn)性可能是主要問題之一。同種方 法在不同批號的色譜柱上可能有不同的結(jié)果，任何意外的結(jié)果都應(yīng) 進行研究，以找出其原因，避免在日后的工作中出現(xiàn)同類錯誤。 sQsAEJkW5T表6 完善方法應(yīng)預備數(shù)據(jù)表明所需方法的性能;應(yīng)

10、有為其它操作者使用的書面分析步驟；以一個以上的系統(tǒng)或操作者，用包括期望組分和期望被測物濃 度的樣品系統(tǒng)地論證方法的性能；比較不同時間和不同實驗室之間的實驗 數(shù)據(jù)；應(yīng)得到色譜柱的期望壽命以及柱間重現(xiàn)性的數(shù)據(jù)；研究不正常的結(jié)果，以糾正潛在的問題；研究所有影響分離的條件溫度、流動相組成、pH等）；規(guī)定 這些條件的限度；對可能發(fā)生的問題關(guān)鍵譜峰對分離不足；隨運行時間延長，最末譜峰保留值增加等）提出建議措施。備注：主要用于日常工作或質(zhì)量監(jiān)控方法上表的要求適用于滿足精密準確、穩(wěn)定可靠并可移植轉(zhuǎn)讓的嚴 格HPLC標準方法。在其它情況下，可能只要求一次成功的分離或能 快速、“粗略”地答復某一特定問題，此時可免

11、掉表5和表6中的 許多建議，圖1中一些步驟也可能是不必要的，僅明白并知道一個 方法建立方案的真實目標就足夠了。GMsIasNXkA解決出現(xiàn)的問題隨著方法建立的進行，會出現(xiàn)各種問題，其中有些已在表7中 列出，其它的問題包括：開始時色譜圖中有的譜峰可能比所期望的 要寬塔板數(shù)低），或譜峰嚴重拖尾；在方法應(yīng)用中還會發(fā)現(xiàn)用同一 或不同）廠家的“規(guī)格相同”色譜柱替代原柱后，分離情況會變得 難以接受，常規(guī)實驗室無法用規(guī)格相同的）另柱重復此方法；色譜 柱壽命也可能很短 如進樣不足100次即不能再用）； 同一色譜 柱）重復進樣的色譜圖不一樣，定量精度較差，保留時間從一系列 運行的開始直至結(jié)束一直漂移；在后面樣品的色譜圖中可能出現(xiàn)了 其它峰干擾被測物測定等。TIrRGchYzg表7方法建立和論證期間可能出現(xiàn)的問題問題評論塔板數(shù)低色譜柱選擇不對，二次保留、峰形不好的影響色譜柱易變 性色譜柱選擇不對，二次保留的影響色譜柱壽命 短色譜柱選擇不對，樣品需預處理保留值變化色譜柱平衡不夠，樣品需預處理，鍵 合相流失定量精度差需更好地校正，找出誤差的來源出現(xiàn)新的千 擾峰初始分離不夠或初始樣品無代表性對于將長期使用的常規(guī)方法，最好在正式應(yīng)用之前，對這些問 題進行預測并加以改善。進人日常應(yīng)用后才發(fā)現(xiàn)方法性能不好是不 愿看到的情況，方法重現(xiàn)性差會影響質(zhì)量控制或生產(chǎn)