細(xì)菌培養(yǎng)及菌體收集

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)專心-專注-專業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)基因工程實驗流程參考圖：堿變性法提取質(zhì)粒DNA序列比對以及系統(tǒng)發(fā)育樹的建立陽性克隆送樣測序質(zhì)粒DNA酶切驗證陽性克隆篩選轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)制備PCR產(chǎn)物純化細(xì)菌基因組DNA的16srRNA片段PCR擴(kuò)增細(xì)菌基因組DNA的電泳鑒定細(xì)菌基因組DNA的提取與pMD18-T載體的連接確定菌株分類地位細(xì)菌培養(yǎng)及菌體收集挑取單菌落于5 ml 2216E培養(yǎng)基中，8培養(yǎng)， 100 rpm轉(zhuǎn)速，振蕩120 h后，12 000 rpm離心15 min。棄去上清液，加入10 ml TE

2、洗滌離心后，用10 ml TE溶解菌體，混勻，20保存?zhèn)溆?。實驗一：菌株基因組DNA的提取 （CTAB 方法）CTAB/NaCL溶液配制：CTAB/NaCL溶液(10% CTAB，0.7M NaCL 4.1gNaCL 溶于80ml水中，緩慢加入10gCTAB，加熱溶解)；原理：采用溶菌酶破碎細(xì)菌細(xì)胞壁，加入去污劑CTAB和EDTA消化細(xì)胞，可使核蛋白體解析，然后使蛋白和多糖雜質(zhì)沉淀，DNA進(jìn)入水相，再用酚、氯仿抽提純化。最后得到DNA。操作流程：取3.5 ml菌懸液，加入184 l 10% SDS，混勻，溶菌酶濃度為2mg/ml，37溫育1 h。加入740 l 5 M NaCl，再加入512

3、l CTAB/NaCl，混勻，65溫育10 min。加入等體積氯仿/異戊醇（24:1），混勻，10 000 rpm離心5 min，吸取上清液。上清液中加入等體積苯酚氯仿異戊醇(25241)，混勻，10 000 rpm離心5 min，吸取上清液。加入0.6倍異丙醇，混勻，10 000 rpm離心5 min，收集DNA沉淀，用70%乙醇洗滌DNA沉淀。用1 ml TE溶解DNA，加入終濃度為20 g/ml RNaseA，4溶解過夜，20 保存。實驗二：DNA電泳鑒定1目的學(xué)會常用的DNA瓊脂糖凝膠電泳、。2原理DNA雙螺旋分子骨架兩側(cè)帶有含負(fù)電荷的磷酸根，在電場中會向正極方向移動。不同長度的DNA

4、由于受到凝膠介質(zhì)的阻力不同，表現(xiàn)為不同的遷移率而被分開。3器材電泳儀，水平凝膠電泳槽和梳子及其制膠模塊，250ml三角瓶，微波爐，臺式離心機(jī)，旋渦混合器，凝膠成像系統(tǒng)，分光光度計，微量移液取樣器，1.5ml離心管，雙面微量離心管架，試管架等。4試劑細(xì)菌基因組DNA，TAE電泳緩沖液，1000溴化乙錠儲存液，電泳級瓊脂糖粉，10加樣緩沖液（或6加樣緩沖液），DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（lDNA/ HindIII+EcoRI）。 5實驗準(zhǔn)備 配制TAE電泳緩沖液（50儲存液，pH約8.5：Tris堿 242g，57.1ml冰乙酸，37.2g Na2EDTA.2H2O，dd water 定容至1L），1000

5、溴化乙錠儲存液（0.5mg/ml：50mg溴化乙錠溶于100mL dd water，4C避光儲存），10加樣緩沖液（20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚藍(lán)）；6加樣緩沖液（0.25%溴酚藍(lán)，40%蔗糖水溶液）；1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）。6操作步驟稱取0.5g瓊脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml TAE電泳緩沖液(1)，放入微波爐中燒開（1min）。50ml 正好倒兩塊小膠。注意觀察燒瓶中的瓊脂糖粉末，待完全熔化后停止微波爐（切不可讓膠溶液溢出到微波爐中?。?。戴上線手套，從微波爐

6、中取出三角瓶，置桌面上冷卻致不燙手（約50-60C）。把梳子插到凝膠灌制模具的正確位置后緩緩倒入膠溶液。膠溶液倒至與模具的矮邊緣相平即可，不要把膠溶液溢到外面。在桌面上靜置10-20分鐘待膠完全凝固。（剩下的膠溶液封口后留待以后再熔化使用）。在水平電泳槽中加滿1TAE電泳緩沖液。根據(jù)電泳槽的長度把電泳儀的電壓調(diào)至80V，注意正負(fù)電極的位置連接正確。待膠完全凝固后（15-20分鐘），小心拔出梳子。用手指捏住模具兩側(cè)的高邊緣取出模具和凝膠放入電泳槽中間的平臺上，凝膠要沒入電泳液中。凝膠上有樣品孔的一側(cè)要朝向電泳槽的負(fù)極。剪1片光面紙（或封口膜），點6ml蒸餾水、1ml 10加樣緩沖液，再加入3ml

7、質(zhì)粒DNA溶液制成10ml DNA樣品。在凝膠上選擇相鄰的加樣孔。用10ml的吸液頭分別將管中的樣品加入凝膠的加樣孔中（如果需要時，在相鄰的加樣孔中加入1.5-3ml DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物）。加樣時持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住這只手的手腕，以減少移液器的抖動?？吹剿{(lán)色的樣品吸管尖頭伸進(jìn)加樣孔后（不能伸得太深，以免穿破凝膠的底部）緩緩將藍(lán)色的樣品壓入加樣孔中。切不可使藍(lán)色樣品流到孔外。打開電源開關(guān)，樣品將形成一條藍(lán)色的橫帶向前移動（如果發(fā)現(xiàn)藍(lán)色向后移動，立即關(guān)閉電源，調(diào)換電極）。電泳將進(jìn)行約30min。當(dāng)藍(lán)色的溴酚藍(lán)遷移到距凝膠邊緣1cm時，關(guān)閉電源。取出模具和凝膠。把凝膠小心反扣

8、放入盛有EB的搪瓷盒中。放置約10分鐘后，取出用自來沖洗兩次。放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照。清理垃圾。染有EB的凝膠要放到專用的垃圾袋中作專門處理，以免污染環(huán)境。撰寫實驗報告。7思考泳道中的質(zhì)粒DNA有幾條帶？為什么？溴酚藍(lán)的遷移率相當(dāng)于多少bp的DNA?影響本實驗結(jié)果的因素有哪些？實驗三：PCR擴(kuò)增 1目的學(xué)會PCR操作的基本技術(shù)。2原理 是將待擴(kuò)增的DNA模板加熱變性，與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡聚核苷酸引物復(fù)性，然后經(jīng)過耐熱的DNA聚合酶延伸。再進(jìn)入下一輪變性復(fù)性延伸的循環(huán)，n次循環(huán)后DNA可被擴(kuò)增（1+X）n倍。其中25nt的引物退火溫度Tm=2（A+T）+4（G+C）。3器材旋渦混合器，微量移液取樣器

9、，移液器吸頭，0.2ml PCR微量管， PCR儀，臺式離心機(jī)，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)。4試劑 5U/l Taq DNA聚合酶，PCR緩沖液（10，MgCl2 free），25mM MgCl2，dNTP，引物，模板（細(xì)菌基因組DNA），無菌dd water。 5實驗準(zhǔn)備 dNTP混合液（每種25mM），TAE電泳緩沖液，1000溴化乙錠儲存液（0.5mg/ml），10加樣緩沖液，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）。 合成的引物：16S rRNA基因PCR引物序列引物名稱Primers對應(yīng)于E. coli 16S rRNA基因堿基位置 Location of 1

10、6S rRNA gene for E. coli引物序列Primers sequencesGM3F8275-GGTTACCTTGTTACGACTT-3GM4R148815075-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 待擴(kuò)增的16srRNA片段長度：大約1500bp。6操作步驟在0.2ml PCR 微量離心管中配制50l反應(yīng)體系。（以下加樣量供參考，括號內(nèi)是最終需要量，實驗時需參照Taq酶說明書計算）PCR反應(yīng)體系成分Component反應(yīng)濃度Concentrations 無菌雙蒸水定容至25 l10 PCR Buffer1 PCR Buffer（2.5 l）MgCl2 25 mM1.6

11、 ldNTP （各2.5 M）2.0 l引物1.0 l模板DNA0.5 lTaq DNA 聚合酶0.2 l （2）根據(jù)廠商的操作手冊設(shè)置PCR儀的循環(huán)程序： 94 5min 94 1min 50 1min 72 1min30s goto 29 times 72 10min（3）PCR結(jié)束后，取10l產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。觀察膠上是否有預(yù)計的主要產(chǎn)物帶。（4）清理桌面，撰寫實驗報告。（5）PCR產(chǎn)物可以直接與T載體連接（見后面實驗），然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。7思考 （1）復(fù)性溫度如何確定？ （2）為什么要在最后延伸10min？ （3）是否有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物（或引物二聚體），如何才能消除？ 實驗四：

12、PCR產(chǎn)物的純化（從瓊脂糖凝膠中回收DNA片斷）1目的學(xué)會從瓊脂糖凝膠中回收DNA片斷的基本技術(shù)。2原理 限制性內(nèi)切酶切割后的DNA片斷經(jīng)過電泳后，按分子量大小被分開，排列在瓊脂糖凝膠中，可以將特定的某條DNA帶所在的凝膠切下來，加熱或用特殊的試劑熔解凝膠，使DNA溶回到溶液中，再經(jīng)過乙醇沉淀或過柱即可獲得目的DNA酶切片斷。3器材旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，臺式離心機(jī)，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)，微波爐，水漂，恒溫水浴。4試劑 電泳緩沖液，溴化乙錠溶液，電泳級瓊脂糖粉，10加樣緩沖液，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，DNA凝膠回收試劑盒。 5實驗準(zhǔn)備 配制TA

13、E電泳緩沖液（10儲存液），1000溴化乙錠儲存液（0.5mg/ml），10加樣緩沖液，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）；6操作步驟（1）用1TAE配制1%瓊脂糖凝膠。DNA用合適的酶切。（2）在膠上選定兩個加樣孔，分別加入少量（10l）和大量（50l ）DNA酶切產(chǎn)物，電泳。（3）電泳結(jié)束后用刀片切下含有少量DNA酶切產(chǎn)物的泳道（一般選擇位于凝膠的邊緣），EB染色，在紫外燈下找到目的DNA帶，用刀片切在帶的下上下邊緣各切一個小口作為標(biāo)記。注意：含有大量DNA酶切產(chǎn)物的凝膠既不用EB染色，也不用紫外燈照射?。?）將做好標(biāo)記的凝膠條與未染色的凝膠原位對齊，

14、根據(jù)小膠條上的標(biāo)記估計未染色的大膠上DNA酶切產(chǎn)物的位置，用刀片切下大膠中DNA產(chǎn)物所在的凝膠（盡量不要多余的凝膠），轉(zhuǎn)移至一個稱量過得干凈的1.5ml微量離心管中。再稱量后計算出膠的重量。（5）按照DNA凝膠回收試劑盒的說明書操作，回收DNA酶切產(chǎn)物：采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0對瓊脂糖凝膠中分離PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。具體操作步驟如下：1. 使用TAE緩沖液或TBE緩沖液制作瓊脂糖凝膠，然后對目的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。2. 在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。此時應(yīng)注意 盡量切除不含目的D

15、NA部分的凝膠，盡量減小凝膠體積，提高DNA回收率。注）切膠時請注意不要將DNA長時間暴露于紫外燈下，以防止DNA損傷。3. 切碎膠塊。膠塊切碎后可以加快操作步驟6的膠塊融化時間，提高DNA的回收率。4. 稱量膠塊重量，計算膠塊體積。計算膠塊體積時，以1 mg=1 l進(jìn)行計算。5. 向膠塊中加入膠塊融化液DR-I Buffer。DR-I Buffer的加量如下表：6. 均勻混合后75加熱融化膠塊（低熔點瓊脂糖凝膠只需在45加熱)。此時應(yīng)間斷振蕩混合，使膠塊充分融化（約610分鐘)。注）膠塊一定要充分融化，否則將會嚴(yán)重影響DNA的回收率。7. 向上述膠塊融化液中加入DR-I Buffer量的1/

16、2體積量的DR-II Buffer，均勻混合。當(dāng)分離小于400 bp的DNA片段時，應(yīng)在此溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。8. 將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。9. 將上述操作7的溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12,000 rpm離心1分鐘，棄濾液。注）如將濾液再加入Spin Column中離心一次，可以提高DNA的回收率。10. 將500 l的Rinse A加入Spin Column中，12,000 rpm離心30秒，棄濾液。11. 將700 l的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm離心30秒，棄濾液。12. 重

17、復(fù)操作步驟11。13. 將Spin Column安置于新的1.5 ml的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入25 l 的滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置1分鐘。注）把滅菌蒸餾水或Elution Buffer加熱至60使用時有利于提高洗脫效率。14. 12,000 rpm離心1分鐘洗脫DNA。實驗五：T-A克隆：1目的學(xué)會DNA片斷的體外連接技術(shù)。2原理：經(jīng)Taq DNA聚合酶擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物末端都帶有單個A。正是基于這一原理，pMD18-T質(zhì)粒經(jīng). EcoR V切成平端后，在開口端加上一個T制成T載體，一方面避免了自身環(huán)化，另一方面由. 于T-A互補(bǔ)，從而提高了

18、T載體與PCR產(chǎn)物之間的連接效率.3器材旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，臺式離心機(jī)4試劑 pMD18-T 載體，16srRNA PCR回收產(chǎn)物，無菌dd Water5實驗準(zhǔn)備 1.5ml離心管裝入飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）；平板培養(yǎng)基（含Amp）。6操作步驟 1）PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體直接連接： 1igation mix，5 l；純化的PCR產(chǎn)物，4.5 l；pMD18-T載體，0.5 l。上述反應(yīng)液輕輕震蕩后再短暫離心后于16連接12h以上。7思考：為什么要采用16C下連接？實驗六：大腸桿菌感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化（一

19、）感受態(tài)制備：1目的學(xué)會CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。2原理 細(xì)菌在0C CaCl2低滲溶液中脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易吸收外源DNA的狀態(tài)。3器材旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，50ml 微量離心管，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，臺式冷凍離心機(jī)，制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，分光光度計，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，搖菌試管，三角燒瓶，接種環(huán)。4試劑 E. coli DH5a， LB培養(yǎng)基，0.1 mol/L CaCl2溶液，無菌dd Water5實驗準(zhǔn)備1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）；平板培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基（滅菌），冰冷的0.1 m

20、ol/L CaCl2溶液（滅菌），無菌dd Water，搖菌試管（滅菌），三角燒瓶（滅菌）。6操作步驟 （1）將大腸桿菌（Top10）甘油種接種到5 ml LB液體培養(yǎng)基中，37，200 rpm過夜。然后將1 ml活化的菌種接種到100 ml LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌液OD600nm=0.30.5。（2）4，5 000 rpm離心8 min沉淀菌體。（3） 將菌體沉淀用10 ml冰預(yù)冷的0.1 M無菌CaCl2重懸，于4放置30 min，5 000 rpm離心8 min。（4）棄掉上清，加2 ml冰預(yù)冷的0.1M無菌CaCl2重懸。每200 l分裝一管，置于冰浴待用。思考 （1）制作感受

21、態(tài)菌的過程中，應(yīng)注意那些關(guān)鍵步驟？ （2）CaCl2溶液的作用是什么？（二）轉(zhuǎn)化：1目的學(xué)會質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)受體菌的技術(shù)。2原理 質(zhì)粒DNA粘附在細(xì)菌細(xì)胞表面，經(jīng)過42C短時間的熱擊處理，促進(jìn)吸收DNA。然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，待質(zhì)粒上所帶的抗菌素基因表達(dá)，就可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長。3器材旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣浴（或恒溫水浴鍋），制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，培養(yǎng)皿（已鋪好固體LB-Amp），超凈工作臺，酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱。4試劑 LB培養(yǎng)基（不加抗菌素），LB培養(yǎng)基（加抗菌素），無菌dd water，IPTG

22、，X-gal。5實驗準(zhǔn)備 無菌dd water，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）6操作步驟（1）取一管感受態(tài)細(xì)胞，加入10 l連接產(chǎn)物，吹吸混勻，冰浴30 min。（2）42熱激90 s，冰浴2 min。（3）加入500 l LB液體培養(yǎng)基，37振搖45 min。（4）取200 l菌液涂布在加有氨芐青霉素（Amp, 50 mg/L）的LB抗性平板上，37培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待菌液完全吸收后倒置培養(yǎng)過夜。實驗七：陽性克隆的篩選（一）粗篩：（1）對于每個菌株隨機(jī)挑取34個單菌落于EP管中（每管加1ml LB液體培養(yǎng)基，另加50 mg/l Amp），37，200 r

23、pm振蕩培養(yǎng)9h。（2）取50 l菌液保種，其余12 000 rpm離心1 min收集菌體。（3）每管菌體加入30 l TE buffer，混勻后加入等體積苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），渦旋器震蕩1min。（4）12 000 rpm離心5min，取上清進(jìn)行電泳檢測，根據(jù)質(zhì)粒大小找出陽性克隆，進(jìn)一步提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。（二）堿變性法提取質(zhì)?；驹碓恚涸趐H 12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA變性，而共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)。將PH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)，通過離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。試劑溶液： 50mM 葡萄糖25mM TrisHCl（pH8.0）10mM EDTA溶液：（新鮮配制）0.2N NaOH1% SDS溶液： 5M KAC 10ml冰醋酸 11.5ml水 28.5ml酚，氯仿，乙醇 RNase 瓊脂糖： 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTA實驗方法 （1）取50 l陽性克