羌活和寬葉羌活簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增反應(yīng)體系的正交優(yōu)化

1、羌活和寬葉羌活簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增反響體系的正交優(yōu)化 古松蔣舜媛唐學(xué)芳孫輝楊志榮孫群【摘要】目的通過(guò)討論羌活和寬葉羌活I(lǐng)SSR實(shí)驗(yàn)中各種因素的影響，以建立羌活和寬葉羌活的簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增ISSR-PR最正確反響體系。方法利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)對(duì)羌活和寬葉羌活I(lǐng)SSR-PR反響體系的4因素g2+，dNTP，引物，Taq酶在3個(gè)程度上進(jìn)展優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，PR結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，并設(shè)置梯度PR進(jìn)展引物退火溫度篩眩結(jié)果在20lISSR-PR反響體系中，各組分的最適濃度為：2.0l/Lg2+，250l/LdNTPs，0.50l/L引物，1UTaq酶，40ngDNA模板；模板DNA40

2、90ng，不同引物有不同的最正確退火溫度，范圍在4852。結(jié)論該優(yōu)化體系的建立為進(jìn)一步進(jìn)展羌活和寬葉羌活種群間遺傳多樣性研究提供了參考?！娟P(guān)鍵詞】羌活寬葉羌活簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Keyrds:Ntpterygiuinisu;N.frbesii;ISSR-PR;rthgnaldesign1材料與方法1.1材料1.2試劑與儀器ISSR引物采用加拿大大不列顛哥倫比亞大學(xué)UniversityfBritishlubia提供的引物序列set#9，N.801-900，經(jīng)挑選以UB827，即(A)8G作為此次正交實(shí)驗(yàn)的固定引物，由北京賽百勝基因技術(shù)合成；100bpDNALadder購(gòu)自Ferent

3、as；DL2000購(gòu)自清華天為時(shí)代；dNTP、TaqDNA聚合酶購(gòu)自大連寶生物；瓊脂糖為Siga公司產(chǎn)品，其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。PR反響在美國(guó)J公司的PT-200型PR循環(huán)儀上進(jìn)展。DNA濃度和純度測(cè)定使用英國(guó)Bihr公司消費(fèi)的GeneQuantPr核酸檢測(cè)儀。1.3DNA的提取和測(cè)定參照鄒喻萍等9改良TAB稍加改動(dòng)，提取其DNA，用核酸檢測(cè)儀測(cè)定所提DNA的濃度和純度，并在0.8%瓊脂糖凝膠上通過(guò)電泳檢測(cè)其是否降解，然后稀釋成30ng/l，備用。1.4PR反響體系的正交實(shí)驗(yàn)采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)10，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，由g2+,dNTP,引物和Taq酶4因素各3程度組成。見(jiàn)表1。表1I

4、SSR-PR正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表L9(略)以上9個(gè)組合，每個(gè)處理2次重復(fù)，按表1加樣。反響體系總體積為20l，引物為UB827(A)8G。除上述變化因素外，每管還包括1PRbuffer，40ng模板DNA。反響程序?yàn)椋?4預(yù)變性5in；94變性30s，50退火45s，72延伸2in，循環(huán)35次；72延伸5in；4保溫，終止反響。PR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠于不超過(guò)5V/的電壓下電泳，電極緩沖液為1TAE或0.5TBE，在含有0.5gl-1EB中染色30in，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄和分析。結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展分析，得到ISSR-PR反響各因素的最正確程度。1.5退火溫度的梯度挑選根據(jù)正交實(shí)

5、驗(yàn)挑選出的最正確反響體系，對(duì)經(jīng)初篩出的引物進(jìn)展退火溫度梯度挑選，根據(jù)理論退火溫度，設(shè)定在46.060.0之間，擴(kuò)增儀自動(dòng)生成12個(gè)溫度梯度：46.0，46.4，47.2，49.9，52.0，54.3，56.3，57.8，59.7，60.0，根據(jù)電泳結(jié)果挑選出各引物的最正確退火溫度。2結(jié)果與分析2.1正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析dNTP作為PR反響原料，量太少會(huì)使擴(kuò)增反響進(jìn)展不完全；量過(guò)多，那么會(huì)對(duì)g2+產(chǎn)生拮抗作用，且造成不必要的浪費(fèi)。多重比較顯示圖2b本實(shí)驗(yàn)所選梯度范圍dNTP對(duì)PR反響結(jié)果均值隨其濃度增加呈緩慢上升趨勢(shì)，以2.50lL-1最正確。g2+主要是通過(guò)改變聚合酶的活性對(duì)PR反響結(jié)果產(chǎn)生影響

6、，本實(shí)驗(yàn)各濃度程度對(duì)結(jié)果的影響有一定差異，表現(xiàn)為1.52.0lL-1范圍內(nèi)，反響結(jié)果均值隨g2+濃度平均值遞增，但差異不顯著，二者與2.5lL-1程度間差異顯著圖2a，本文確定g2+濃度為2.0lL-1。引物濃度的0.25，0.50lL-1和0.75lL-1程度間差異顯著，說(shuō)明引物濃度程度變化對(duì)PR產(chǎn)物電泳是影響ISSR擴(kuò)增的一個(gè)重要因素，引物濃度過(guò)高易引起堿基錯(cuò)配和產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，還易形成引物二聚體；引物濃度過(guò)低，其與DNA模板結(jié)合位點(diǎn)少，擴(kuò)增產(chǎn)量下降，且擴(kuò)增結(jié)果不穩(wěn)定如圖1中1，6，8號(hào)處理所示。本實(shí)驗(yàn)中引物濃度定為0.50lL-1，將此濃度用于不同引物的擴(kuò)增均獲得良好效果圖2。Taq酶

7、對(duì)PR反響的影響在所選梯度范圍呈正相關(guān)，即隨著Taq酶量增加，結(jié)果均值呈上升趨勢(shì)圖2d，但對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響相對(duì)較校根據(jù)對(duì)羌活和寬葉羌活樣品數(shù)據(jù)分別分析，并結(jié)合對(duì)Taq酶單獨(dú)進(jìn)展梯度實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，1.0U表現(xiàn)最為穩(wěn)定，故在20l體系里選擇1.0U為最正確反響程度。2.2不同退火溫度對(duì)ISSR-PR擴(kuò)增的影響PR反響中，退火溫度直接影響引物與模板的特異性結(jié)合13，根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的結(jié)果,選擇2號(hào)處理進(jìn)展退火溫度的梯度挑選實(shí)驗(yàn)，在JResearhPT-200擴(kuò)增儀上自動(dòng)生成12個(gè)溫度，進(jìn)展溫度梯度比較，結(jié)果見(jiàn)圖3說(shuō)明，退火溫度過(guò)低那么擴(kuò)增特異性差，背景深；退火溫度過(guò)高，那么引物與模板結(jié)合差，PR產(chǎn)物豐

8、度低，電泳條帶亮度校并且引物不同，其所需的最適退火溫度區(qū)間也有差異。對(duì)其它引物進(jìn)展梯度PR擴(kuò)增亦得到了相似結(jié)果，由于ISSR引物較長(zhǎng)，可相對(duì)進(jìn)步ISSR反響的退火溫度，以進(jìn)步反響的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。圖3顯示，UB835的適宜退火溫度是48，而UB864的最適退火溫度為52左右。3討論由于ISSR分子標(biāo)記技術(shù)基于PR反響，其擴(kuò)增譜帶雖較RAPD標(biāo)記穩(wěn)定，但同樣受反響條件和擴(kuò)增程序變化以及物種不同的影響9。有的研究認(rèn)為Taq酶的濃度變化影響最大12，有的認(rèn)為PR對(duì)g2+最為敏感14，有的研究結(jié)果顯示dNTP影響最大15，可能由于實(shí)驗(yàn)材料的不同及反響各因素的綜合作用等原因?qū)е卤緦?shí)驗(yàn)結(jié)論有所不同。正交實(shí)

9、驗(yàn)法用于PR反響條件優(yōu)化已見(jiàn)諸報(bào)道11，12，14，15，雖然實(shí)驗(yàn)結(jié)果的定量判斷根據(jù)帶有一定主觀性和個(gè)體差異，不能很好地估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差等局限性，但此法能通過(guò)較少量的實(shí)驗(yàn)，較快找到影響反響條件的主要因素的較為優(yōu)化的程度組合，防止了單一因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的缺乏，不失為一種快捷、高效的實(shí)驗(yàn)挑選方法。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)羌活屬兩種植物樣品開(kāi)展正交挑選，優(yōu)化組合結(jié)果顯示出較高的一致性，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證確定了最優(yōu)組合，將為下一步開(kāi)展羌活遺傳多樣性等研究打下了良好的基矗4結(jié)論本實(shí)驗(yàn)利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，初步建立并優(yōu)化了羌活和寬葉羌活I(lǐng)SSR標(biāo)記的PR反響體系。這一反響體系受諸多因素的影響，包括g2+濃度，dNTPs，引物，Taq酶、和DNA模板等各反響成分都會(huì)影響PR產(chǎn)物的生成和質(zhì)量。采用兩種分析方法對(duì)4因素g2+，dNTPs，引物，Taq酶3程度的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)展分析比較，得到相似結(jié)果，均顯示在本實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的因素程度范圍內(nèi)，引物濃度對(duì)PR實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最大，且不同程度間差異極顯著，而dNTPs影響較校本實(shí)驗(yàn)研究還說(shuō)明，對(duì)羌活和