非小細(xì)胞肺癌基因檢測(cè)PPT

1、關(guān)于非小細(xì)胞肺癌基因檢測(cè)第一張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月前言隨著分子醫(yī)學(xué)進(jìn)展和靶向藥物的不斷涌現(xiàn)，晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的治療已進(jìn)入到個(gè)體化治療的時(shí)代。目前臨床應(yīng)用的個(gè)體化靶向治療主要針對(duì)EGFR突變型和ALK融合基因型肺癌,這兩種基因變異型肺癌均具有明確的分子靶點(diǎn)、靶點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)及上市的靶向藥物，臨床療效得到明顯提高。第二張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月EGFR突變檢測(cè)中需要明確的幾個(gè)基本概念2、基因突變是指DNA發(fā)生堿基序列的改變：須選擇有針對(duì)性的檢測(cè)手段，針對(duì)非DNA的檢測(cè)手段如：RT-PCR（檢測(cè)RNA表達(dá)），免疫組化（檢測(cè)蛋白表達(dá)）以及針對(duì)非堿基序列的檢

2、測(cè)手段如：FISH（檢測(cè)DNA的擴(kuò)增、缺失、斷裂、融合）等，均不適用。體細(xì)胞突變發(fā)生在非種系組織中不具有遺傳性不會(huì)遺傳給子代種系突變發(fā)生于精子或卵子中可以遺傳子代子代所有細(xì)胞均帶突變1、EGFR突變?yōu)轶w細(xì)胞突變：發(fā)生于腫瘤細(xì)胞中，正常細(xì)胞（癌旁或白細(xì)胞等）不含突變。要盡可能取到足量的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，這是保證檢測(cè)結(jié)果可靠的根本前提。第三張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月EGFR基因突變檢測(cè)概念EGFR突變檢測(cè)指腫瘤組織中編碼EGFR基因的DNA突變狀態(tài)檢測(cè)并不是：EGFR基因DNA拷貝數(shù)的檢測(cè)（FISH法）EGFR蛋白表達(dá)量的檢測(cè)（IHC法）。EGFR檢測(cè)檢測(cè)物質(zhì)部位方法基因突變DNA

3、細(xì)胞核測(cè)序法、ARMS法等拷貝數(shù)DNA細(xì)胞核熒光原位雜交法（FISH）蛋白表達(dá)蛋白質(zhì)細(xì)胞膜免疫組化法（IHC）RNA表達(dá)RNA細(xì)胞核RT-PCRX第四張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Nature Review 2007, 7:169NSCLC中EGFR酪氨酸激酶區(qū)突變種類(lèi)第五張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第六張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月標(biāo)本采集及病理評(píng)估DNA 抽提及質(zhì)控檢測(cè)報(bào)告EGFR突變檢測(cè)ARMS測(cè)序法其它方法EGFR 突變檢測(cè)流程第七張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月EGFR突變檢測(cè)中的相關(guān)角色患者臨床醫(yī)生胸外科醫(yī)師內(nèi)鏡醫(yī)師收集肺癌組織標(biāo)本病

4、理科醫(yī)生準(zhǔn)備樣本實(shí)驗(yàn)操作及結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)室人員報(bào)告結(jié)果給臨床醫(yī)生腫瘤科醫(yī)生放療科醫(yī)生呼吸科醫(yī)生第八張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月用于EGFR突變檢測(cè)的標(biāo)本腫瘤組織目前最可靠的標(biāo)本；其它樣本： 外周血（血漿、血清） 細(xì)胞學(xué) （胸水、痰液細(xì)胞學(xué)） 支氣管刮取物 仍需進(jìn)一步研究確定這些樣本在臨床實(shí)踐及診斷中的應(yīng)用第九張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月標(biāo)本問(wèn)題石蠟組織：盡可能送檢一年內(nèi)的石蠟標(biāo)本。石蠟切片：含腫瘤細(xì)胞越多越好（50%以上）；組織部位面積約6mm x 6mm以上；包埋組織：組織塊不小于0.50.50.5（cm）。新鮮組織：比石蠟等處理過(guò)的舊組織，DNA保存得更完整，對(duì)P

5、CR實(shí)驗(yàn)更有利，但一定要經(jīng)病理學(xué)確認(rèn)。含有腫瘤組織50%以上；重量10g（約米粒大小以上），經(jīng)PBS或生理鹽水沖洗干凈。取癌組織的中心位置組織塊（避開(kāi)壞死區(qū)域），固定于10%中性福爾馬林溶液中，盡快送病理科。細(xì)胞學(xué)標(biāo)本：可用原發(fā)灶與復(fù)發(fā)灶：只要能獲得足夠的癌細(xì)胞，均可；但對(duì)于復(fù)發(fā)的患者，再次活檢不僅可確診，還可以獲得分子標(biāo)志物的進(jìn)一步信息。第十張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月標(biāo)本因素對(duì)EGFR突變檢測(cè)的影響-腫瘤組織特點(diǎn)-遺傳異質(zhì)性 對(duì)檢測(cè)方法敏感度有較高要求正常細(xì)胞混雜第十一張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月標(biāo)本因素對(duì)EGFR突變檢測(cè)的影響-組織標(biāo)本種類(lèi)- 對(duì)檢測(cè)方法有相應(yīng)

6、要求，組織標(biāo)本及DNA質(zhì)控尤其重要 冰凍新鮮組織 固定包埋組織-外科手術(shù)標(biāo)本完整，量多廣泛-小活檢標(biāo)本完整，量少受限-外科手術(shù)標(biāo)本片段化，量多受限-小活檢標(biāo)本片段化，量少極度受限D(zhuǎn)NA質(zhì)與量適用方法第十二張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月圖4. EGFR基因檢測(cè)使用的臨床樣本及其操作。A.被切成10微米的石蠟包埋標(biāo)本。B.在支氣管鏡下將刷檢樣本放在生理鹽水中洗凈（懸?。?，可以就這樣冷凍保存，C.進(jìn)一步將該生理鹽水液離心，沉淀溶解于AL緩沖液，此狀態(tài)可以室溫保存。 第十三張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月腫瘤組織標(biāo)本的采集及病理評(píng)估腫瘤組織標(biāo)本病理學(xué)評(píng)估組織切片非小細(xì)胞性肺癌診斷

7、及類(lèi)型腫瘤細(xì)胞比例腫瘤細(xì)胞總數(shù)標(biāo)識(shí)腫瘤豐富的區(qū)域富集腫瘤細(xì)胞H&E 染色片用于病理評(píng)估白片用于提取DNA建議最少切片數(shù)：-手術(shù)標(biāo)本，5 m X4-小活檢標(biāo)本，5 m X8 組織標(biāo)本來(lái)源手術(shù)標(biāo)本支氣管下活檢經(jīng)皮穿刺活檢 標(biāo)本處理及貯存新鮮凍存：液氮或-80CFFPE第十四張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月檢測(cè)方法目前 EGFR 基因突變的檢測(cè)方法很多DNA 直接測(cè)序法應(yīng)用廣泛，可檢測(cè)已知的突變和未知的突變，但對(duì)標(biāo)本的腫瘤細(xì)胞含量要求較高，一般要求標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞的比例在 50% 以上，至少不低于 30%?；趯?shí)時(shí)熒光定量 PCR 基礎(chǔ)上的方法（如 ARMS 法）較直接測(cè)序法更加敏感，可檢測(cè)

8、樣品中 1.0%0.1% 的突變基因，更適合用于腫瘤細(xì)胞含量較少的小標(biāo)本檢測(cè)。ARMS 方法操作簡(jiǎn)單，是目前臨床上較常用的方法之一，但只能檢測(cè)已知的突變，且標(biāo)本需進(jìn)行預(yù)處理，檢測(cè)費(fèi)用較高。第十五張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月直接測(cè)序法流程及數(shù)據(jù)分析PCR*純化測(cè)序反應(yīng)測(cè)序儀毛細(xì)管電泳純化數(shù)據(jù)分析EGFR deletionEGFR L858R電泳質(zhì)控組織標(biāo)本DNA*PCR是關(guān)鍵：-特異性-產(chǎn)物長(zhǎng)度-必要時(shí)巢式-建議通用測(cè)序引物第十六張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月DNAARMS反應(yīng)實(shí)時(shí)定量 PCRARMS法操作流程及數(shù)據(jù)解讀數(shù)據(jù)分析內(nèi)參信號(hào) (HEX)突變信號(hào): + -內(nèi)參

9、信號(hào): + +標(biāo)本 1（突變陽(yáng)性）標(biāo)本 2（突變陰性）突變信號(hào) (FAM)組織標(biāo)本內(nèi)參信號(hào) (HEX)第十七張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月測(cè)序法與ARMS法比較測(cè)序法ARMS敏感度20-30%1%FFPE標(biāo)本成功率低高檢測(cè)流程復(fù)雜慢長(zhǎng)簡(jiǎn)單快速數(shù)據(jù)分析要求高低假陽(yáng)性機(jī)會(huì)(交叉污染)多少假陰性機(jī)會(huì)多少儀器成本高低商用試劑盒無(wú)有試劑成本低略高第十八張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月小結(jié)：了解你的標(biāo)本-新鮮/冰凍組織FFPE組織-手術(shù)標(biāo)本小活檢標(biāo)本選擇合適的方法-ARMS是目前較敏感快速方法，且容易開(kāi)展-測(cè)序是傳統(tǒng)的方法，但敏感度有限，過(guò)程復(fù)雜，不易普及做好組織標(biāo)本及DNA質(zhì)控是關(guān)

10、鍵非腫瘤組織標(biāo)本的有效利用-在無(wú)腫瘤組織情況下，外周血cfDNA、胸水及細(xì)針穿刺等細(xì)胞學(xué)標(biāo)本均可用于檢測(cè)EGFR突變，但其確切的敏感度與特異性尚需進(jìn)一步探索-必須選擇足夠敏感的方法第十九張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月EGFR激酶抑制劑的耐藥性作為臨床上的最大問(wèn)題，吉非替尼初期有效的全部患者，在后期均產(chǎn)生耐藥。其中50%患者是在缺失或L858R等的敏感性突變的基礎(chǔ)上，又發(fā)生了第790位密碼子蘇氨酸向蛋氨酸的突變（T790M）。在EGFR-TKI治療前很少存在T790M（13%22），這種情況下TKI難以有效。另外50%患者中，其中大約一半患者的耐藥性是由MET基因擴(kuò)增引起的，EGFR

11、-TKI抗藥性出現(xiàn)時(shí)再進(jìn)行基因檢測(cè)，可以選擇與其耐藥機(jī)制相對(duì)應(yīng)的治療方法。即在一個(gè)患者的各種臨床情況中，掌握EGFR與相關(guān)基因的信息，以期進(jìn)一步改善臨床療效。 第二十張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月EGFR激酶抑制劑耐藥的處理原則對(duì)于緩慢進(jìn)展的患者，建議繼續(xù)使用原來(lái)的 EGFR-TKI 治療或 EGFR-TKI 聯(lián)合化療；對(duì)于快速進(jìn)展的患者，推薦停用 EGFR-TKI，改用化療；于局部進(jìn)展且原有病灶控制良好的患者，建議繼續(xù)使用 EGFR-TKI 并聯(lián)合局部治療。第二十一張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月EGFR激酶抑制劑耐藥研究進(jìn)展第一代EGFR抑制劑Gefitinib (易

12、瑞沙, Iressa)和Erlotinib (特羅凱, Tarceva) 隨著其在臨床上的廣泛應(yīng)用，耐藥問(wèn)題日益突出。其中，EGFR-T790M突變約占臨床耐藥病人的60%以上。第二代EGFR抑制劑Afatinib(阿法替尼)。于2013年9月FDA批準(zhǔn)上市，于2014年1月在3期臨床研究中以失敗告終。Afatinib在體外對(duì)EGFR-T790M突變有活性，但臨床仍然未能克服T790M突變產(chǎn)生的耐藥性。第三代EGFR抑制劑。國(guó)外多個(gè)制藥公司和研究機(jī)構(gòu)都在開(kāi)展對(duì)T790M突變的小分子抑制劑研究，其中包括克洛維斯腫瘤公司的CO-1686和阿斯利康的AZD9291, 但還沒(méi)有針對(duì)該突變的藥物上市。第

13、二十二張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 ALK 融合基因是新發(fā)現(xiàn)的 NSCLC 驅(qū)動(dòng)基因，其中棘皮動(dòng)物微管相關(guān)類(lèi)蛋白 4（EML4）基因與 ALK（間變性淋巴瘤激酶）的融合（EML4-ALK）為最常見(jiàn)類(lèi)型。ALK 融合基因主要出現(xiàn)在不吸煙或少吸煙的肺腺癌患者，且通常與 EGFR 基因突變不同時(shí)存在于同一患者。NSCLC 患者中 ALK 融合基因的發(fā)生率約為 5%，而在 EGFR、KRAS、HER2 或 TP53 等基因無(wú)突變的 NSCLC 患者中，ALK 融合基因陽(yáng)性率達(dá) 25%；我國(guó) EGFR 和 KRAS 均為野生型的腺癌患者中 ALK 融合基因的陽(yáng)性率高達(dá) 30%42% 。病理

14、形態(tài)學(xué)研究提示在含印戒細(xì)胞的粘液型或?qū)嵭韵侔┲?，ALK的發(fā)生率高于其他類(lèi)型的肺腺癌（46.2% vs 8%）ALK陽(yáng)性的NSCLC雖然僅占全部NSCLC的5%，但是每年新發(fā)病例數(shù)在中國(guó)仍接近30,000例ALK融合基因概念第二十三張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月目前檢測(cè) ALK 融合基因的常用方法主要有熒光原位雜交技術(shù)（FISH）、基于 PCR 擴(kuò)增基礎(chǔ)上的技術(shù)和免疫組織化學(xué)方法（IHC）。FISH 目前仍是確定 ALK 融合基因的參照標(biāo)準(zhǔn)方法，但價(jià)格昂貴，操作規(guī)范要求較高，尚不適用于 ALK 陽(yáng)性患者的篩查。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 操作簡(jiǎn)便，敏感度高，但需要特定的試劑盒和儀器。IHC

15、 簡(jiǎn)便易行、價(jià)格便宜、操作方法成熟。VentanaALK 融合蛋白 IHC 診斷試劑盒在不影響特異度的前提下，進(jìn)一步提高了敏感度，與 FISH 結(jié)果的吻合率達(dá)到 98.8%，可重復(fù)性達(dá) 99.7%，已經(jīng)獲 CFDA 批準(zhǔn)用于診斷 ALK 陽(yáng)性的 NSCLC 患者。ALK融合基因檢測(cè)方法第二十四張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月ALK融合基因陽(yáng)性有效靶向藥物針對(duì)ALK靶點(diǎn)的小分子抑制劑克唑替尼（Crizotinib）是一種ATP競(jìng)爭(zhēng)性酪氨酸激酶抑制劑，可特異性靶向抑制ALK激酶，也可抑制c-MET和ROS1等信號(hào)通路。臨床試驗(yàn)顯示對(duì)于ALK陽(yáng)性的晚期NSCLC患者，克唑替尼的療效顯著優(yōu)于傳統(tǒng)化療，二線(xiàn)單藥治療患者的中位PFS為7.7個(gè)月，有效率達(dá)到65.3%4?；谄淞己玫寞熜Ш湍褪苄?，2013年初，中國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）已批準(zhǔn)克唑替尼用于治療ALK融合陽(yáng)性的局部晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC患者常見(jiàn)不良反應(yīng)（發(fā)生率25%）包括視力障礙、惡心、腹瀉、水腫及便秘等第二十五張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于