【精品文檔-管理手冊(cè)學(xué)】自體和異體血液在全血分離實(shí)驗(yàn)體系中對(duì)免疫

1、自體和異體血液在全血分離實(shí)驗(yàn)體系中對(duì)免疫細(xì)胞因子的影響_人力資源管理論文-畢業(yè)論文作者：網(wǎng)絡(luò)收集下載前請(qǐng)注意：1：本文檔是版權(quán)歸原作者所有，下載之前請(qǐng)確認(rèn)。2：如果不曉得侵犯了你的利益，請(qǐng)立刻告知，我將立刻做出處理3：可以淘寶交易，七折時(shí)間：2010-06-10 20:22:48 作者：夏曉峰 郭峰 錢寶華 花美仙【摘要】 目的：運(yùn)用系統(tǒng)血液免疫反應(yīng)分離實(shí)驗(yàn)體系，探討在抗原激活的情況下異體血細(xì)胞對(duì)反應(yīng)體系中細(xì)胞因子含 量水平影響的變化規(guī)律。方法：以 S180 作為激活抗原，加異體血細(xì)胞與自體血細(xì)胞對(duì)比，37孵育 1 h，取上清液用 ELISA 法測(cè)定 IL-8、TNF -、IFN -的分泌量。

2、結(jié)果：IL-8 的分泌量異體紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組（）%與自體紅細(xì)胞對(duì)照組（）%相比明顯上升（P ）；TNF -的分泌量異體紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組 （）%與自體紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組（）%相比明顯下降（P ）；IFN -分泌量無(wú)明顯差異。結(jié)論：異體紅細(xì)胞對(duì)自體血液免疫反應(yīng)細(xì)胞因子的分泌具有雙向調(diào)控作用，提示異體輸血對(duì)受者的血液免疫反應(yīng)具有干擾和失平衡的不良影響。 【關(guān)鍵詞】 淋巴細(xì)胞；紅細(xì)胞；抗原；免疫調(diào)控；細(xì)胞因子 Effects of Autogenetic and Allogenous Blood on Cytokines by Means of Natural Isolated Experimental Syste

3、m Abstract Objective Autogenetic and allogenous erythrocytes regulate the immunological reactions activated by antigens by means of natural isolated experimental system, to observe the changes of cytokines. Methods Using inactivated S180 as activating antigen and autologous plasma as reaction substr

4、atum, After incubation an hour in 37, supernate fluid is suspended and detected the change of IL-8、TNF -and IFN - by ELISA assay. Results The secretion of IL-8 of allogenous erythrocytes experimental group%is much higher than that of autogeneic erythrocytes control group% (P , The level of TNF - of

5、allogenous erythrocytes experimental group%is much lower than that of autogeneic erythrocytes experimental group%(P ; the expression of IFN - 紅細(xì)胞在天然免疫防御網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要作用，紅細(xì)胞在補(bǔ)體系統(tǒng)天然免疫反應(yīng)的參與下有黏附和調(diào)理抗原、清除循環(huán)免疫復(fù)合物、調(diào)控淋巴細(xì)胞表達(dá)免疫分子和細(xì)胞因子等作用。有實(shí)驗(yàn)證明在庫(kù)存血中有多達(dá) 14 種以上炎性細(xì)胞因子，中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和 TNF -濃度的增加在臨床的異體輸血時(shí)都可造成免疫功能的不利影響1。結(jié)合了補(bǔ)體的

6、病原體可以被紅細(xì)胞補(bǔ)體受體免疫分子黏附，激發(fā)對(duì)致病原發(fā)生連鎖的系統(tǒng)血液天然免疫反應(yīng)，同時(shí)紅細(xì)胞還可參與相關(guān)免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。 本實(shí)驗(yàn)研究是運(yùn)用全血分離實(shí)驗(yàn)體系2，通過(guò) ELISA 的方法測(cè)定上清液中相關(guān)細(xì)胞因子 IL-8、TNF -、IFN -分泌量在實(shí)驗(yàn)體系反應(yīng)中的變化，探討其可能存在的臨床意義。 1 材料與方法 材料 酸性枸櫞酸鈉葡萄糖溶液（acid citrate dextrose, ACD）抗凝的健康成人新鮮全血由解放軍上海血站提供。 磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution, PBS）和癌細(xì)胞懸液（S180）由解放軍上海血站血液免疫研究室自行制

7、備。 紅細(xì)胞裂解液（10）購(gòu)于深圳晶美生物公司。 IL-8、TNF -、IFN -酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑盒（ELISA 法）購(gòu)于法國(guó) DIACLONE 公司。 方法 血漿的分離制備 采集新鮮的健康成人 ACD 抗凝全血 10 mL，室溫下 2 000 r/min 離心 5 min，吸取上層血漿至另一試管備用。 紅細(xì)胞懸液（RBC）的制備 小心吸取沉底紅細(xì)胞 100 L，加入 2 mL 生理鹽水溶液中洗滌，2 000 r/min 離心 5 min，棄上清，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)，光學(xué)顯微鏡下觀察證實(shí)不含白細(xì)胞和血小板后，調(diào)整紅細(xì)胞懸液濃度為 1108/mL。 白細(xì)胞懸液（WBC）的制備 取全血細(xì)胞懸液

8、 mL 加 4 mL 蒸餾水在冰水中輕輕混勻作用不超過(guò) 1 min，立即加 4 mL % 氯化鈉液混勻， 2 500 r/min 離心 5 min，棄上清，調(diào)整白細(xì)胞懸液濃度為 1106/mL。 分離實(shí)驗(yàn)體系的設(shè)計(jì)和建立 實(shí)驗(yàn)共分 6 只試管，以自體或異體血漿作為反應(yīng)基質(zhì)，分離實(shí)驗(yàn)組以滅活腹水癌細(xì)胞 S180 作為激活抗原，其對(duì)照組加 NS 作為對(duì)照，即（注：* 為加異體血漿組）： mL 異體 RBC+ mL S180+ mL 自體 WBC+ mL 異體血漿 *（加異體血漿）。 mL 異體 RBC+ mL S180+ mL 自體 WBC+ mL 自體血漿（加自體血漿）。 mL 異體 RBC+

9、mL NS+ mL自體 WBC+ mL 異體血漿 * （加異體血漿）。 mL 異體 RBC+ mL NS+ mL 自體 WBC+ mL 自體血漿（加自體血漿）。 mL自體 RBC+ mL S180+ mL 自體 WBC+ mL 自體血漿（加自體血漿）。 mL 自體 RBC+ mL NS+ mL 自體 WBC+ mL 自體血漿（加自體血漿）。 將上述 6 只試管置于 37水浴箱中溫育 1 h，加蓋，中間搖勻 2 次，間隔 20 min；完成后，2 000 r/min 離心 5 min；小心取出上清液約 400 L 裝入安瓿管中，編號(hào)，置于 -20冰箱中冷藏待測(cè)。 ! 上清液細(xì)胞因子 IL-8、T

10、NF -、IFN -的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)前 20 min 從冰箱中取出試劑盒和待測(cè)樣品，平衡至室溫（25），96 孔板用包被緩沖液稀釋的試劑，每孔加 100 L，4過(guò)夜，洗板 3 次；加 100 L 待檢樣品上清液于已包被的反應(yīng)孔中（同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照），37孵育 1 h，洗板 3 次；于反應(yīng)孔中加入新鮮稀釋的 streptavidin-HRP 100 L，室溫下孵育 20 min，洗板 3 次；于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的 TMB 底物溶液 100 L，避光反應(yīng) 20 min 使其顯色；于各反應(yīng)孔中加入 2 mol/L 硫酸 100 L 終止反應(yīng)；在 ELISA 酶標(biāo)檢測(cè)儀上，于 450 n

11、m 處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔 A 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并比較各孔實(shí)測(cè)值。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以 xs 表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 t 檢驗(yàn)或方差分析，P 為差異顯著。 2 結(jié) 果 IL-8、TNF -、IFN -分泌量（pg/mL）的變化 在 S180 激活情況下，異體紅細(xì)胞能夠?qū)ψ泽w血液免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子發(fā)生調(diào)控作用。其中，IL-8 的分泌量異體紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組 *（）%與自體紅細(xì)胞對(duì)照組 （）%相比表現(xiàn)出明顯上升（P ）；TNF -的分泌量異體紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組（）%與自體紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組（）%相比表現(xiàn)出明顯降低（P ），詳見表 1。 分離體系中各組內(nèi) IL-8、TNF -、IFN -分泌量的變化間相關(guān)性 分

12、離實(shí)驗(yàn)體系中，IL-8 與 TNF -的分泌量相關(guān)性在異體紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組 *（r = ，P ）、異體紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組（r = ，P ）、異體紅細(xì)胞對(duì)照組 *（r = ，P ）、異體紅細(xì)胞對(duì)照組（r = ，P ）和自體紅細(xì)胞對(duì)照組（r = ，P ），詳見表 2。 3 討 論 我們發(fā)現(xiàn)在體外系統(tǒng)血液天然免疫反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，異體紅細(xì)胞（供者）在 S180 抗原激活下，對(duì)自體（受者）淋巴細(xì)胞的免疫活化發(fā)揮雙向調(diào)控作用，與自體紅細(xì)胞組相比，異體紅細(xì)胞組 IL-8 的分泌量呈現(xiàn)一定程度的上升，而 TNF -的分泌量呈現(xiàn)下降，顯示受者免疫反應(yīng)有異常表現(xiàn)，其血液天然免疫功能受到一定程度的抑制與干擾； IFN -的分泌量

13、各組間相比表現(xiàn)紊亂，可能與含量較低有關(guān)，具體原因有待于進(jìn)一步探討。細(xì)胞因子在細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，本課題選取細(xì)胞因子作為研究對(duì)象，觀察其動(dòng)態(tài)變化，在一定程度上能夠反映輸血后受者免疫功能的變化，為臨床輸血治療的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。細(xì)胞因子由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激合成、分泌的一類生物活性物質(zhì)，種類繁多，功能廣泛，可具有拮抗或協(xié)同作用，不同的刺激信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)整合的結(jié)果決定了細(xì)胞的反應(yīng)形式，細(xì)胞因子在免疫的全過(guò)程都發(fā)揮著重要的角色作用?，F(xiàn)已證明紅細(xì)胞參與多種免疫細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)，根據(jù)血液免疫反應(yīng)路線圖理論3，為了增加實(shí)驗(yàn)的敏感度和對(duì)比性，我們采用了全血系統(tǒng)血液免疫反應(yīng)分離實(shí)驗(yàn)研究體系，實(shí)驗(yàn)

14、的敏感度有所增加，在 1 h 快速系統(tǒng)血液天然免疫反應(yīng)體系中，IL-8、TNF -快速發(fā)生改變，提示短時(shí)間內(nèi)異體紅細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)對(duì)自體的淋巴細(xì)胞天然免疫反應(yīng)產(chǎn)生干擾與失平衡的不良影響。自體紅細(xì)胞的存在可以對(duì) IL-8 有吸附抑制作用，但異體紅細(xì)胞做為異抗原對(duì)受者的血細(xì)胞天然免疫反應(yīng)有激活作用，所以顯示異體紅細(xì)胞組 IL-8 含量較自體紅細(xì)胞組增高，但 TNF -反之，異體紅細(xì)胞可抑制血細(xì)胞天然免疫反應(yīng)產(chǎn)生 TNF -，使受者系統(tǒng)血液天然免疫反應(yīng)產(chǎn)生細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)失平衡，因而其值低于自體紅細(xì)胞組。IL-8 主要來(lái)源于巨噬細(xì)胞及其基質(zhì)細(xì)胞，在激活的情況下，淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞也可分泌 IL-8，也可由其

15、他內(nèi)皮細(xì)胞受 TNF 活化后合成，通過(guò)這種方式 IL-8 被認(rèn)為是一種重要的 TNF 誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞活化時(shí)的繼發(fā)介質(zhì)4， TNF -來(lái)源廣泛，主要來(lái)源于巨噬細(xì)胞，在體外抗原激活的情況下，T、B 細(xì)胞也可分泌 TNF -，其能以旁分泌的方式作用于 Th 細(xì)胞，調(diào)節(jié) T 細(xì)胞的功能5。細(xì)胞因子在異體輸血引起免疫抑制與干擾的過(guò)程中起重要作用，紅細(xì)胞作為血循環(huán)中數(shù)量巨大的天然免疫細(xì)胞，是機(jī)體血液免疫反應(yīng)系統(tǒng)中不可缺少的重要組成部分。紅細(xì)胞能夠在血漿補(bǔ)體系統(tǒng)和其他天然免疫活性物質(zhì)的協(xié)同下，對(duì)外來(lái)抗原發(fā)生快速免疫反應(yīng)，可以通過(guò)對(duì)淋巴細(xì)胞增殖分化和多種細(xì)胞因子分泌的調(diào)控發(fā)揮免疫調(diào)控作用6。因此研究自體和異

16、體輸血的主要成分紅細(xì)胞天然免疫調(diào)控能力的變化在臨床診治和判斷預(yù)后等方面有重要的理論創(chuàng)新和應(yīng)用價(jià)值。 通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)可以得出以下結(jié)論：異體紅細(xì)胞對(duì)自體淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)表現(xiàn)出抑制與干擾作用，體現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)中 IL-8 與 TNF -分泌量的變化，各種細(xì)胞因子之間相互調(diào)節(jié)，使細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)失平衡?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Escobar GA, Cheng AM, Moore EE, et al. Stored packed red blood cell transfusion up-regulates inflammatory gene expression in circulating leukocytesJ. Ann Surg, 2007, 246:129-1342郭峰. 血液免疫反應(yīng)路線圖J. 深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2005, 15(1):1-43郭峰. 血液免疫反應(yīng)路線圖實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)酵母多糖激活法J. 深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2005, 15(1):8-104Zompi S, Coluc