大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在與成骨細(xì)胞共育環(huán)境下的成骨特性

1、大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在與成骨細(xì)胞共育環(huán)境下的成骨特性【關(guān)鍵詞】骨髓基質(zhì)干細(xì)胞;成骨細(xì)胞;共培養(yǎng)老年性骨質(zhì)疏松是一種退行性病變，其病理根底是由破骨細(xì)胞引起的“骨吸收大于成骨細(xì)胞(B)引起的“骨形成。B來(lái)源于多潛能骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Ss)，既往研究?jī)A向于研究Ss向B分化，以及分化過(guò)程中的影響條件，對(duì)于B對(duì)Ss分化的影響的研究較少，因此，本研究設(shè)計(jì)并建立了Ss/B共培養(yǎng)模型，并觀察B對(duì)Ss分化的影響。1材料與方法1.2方法1.2.1B的別離、擴(kuò)增及鑒定取10只1日齡乳鼠顱蓋骨,去除軟組織,用PBS緩沖液屢次漂洗,快速剪碎,用11的0.25%胰蛋白酶和0.1%膠原酶于37消化10in。以1200r/in，

2、離心5in,棄上清液,用含20%小牛血清培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞并接種于培養(yǎng)瓶中,于37恒溫、5%2及飽和濕度的細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)。將骨組織塊再用11的0.25%胰蛋白酶和0.1%膠原酶于37消化20in,離心搜集細(xì)胞,并接種于培養(yǎng)瓶中,以上步驟重復(fù)2次。每23d更換培養(yǎng)液,待原代細(xì)胞長(zhǎng)至80%瓶底面積時(shí)以0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化,1瓶分24瓶的比例傳代培養(yǎng)，進(jìn)展擴(kuò)增。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，堿性磷酸酶(ALP)染色觀察細(xì)胞分泌情況及礦化結(jié)節(jié)染色。1.2.2Ss的別離、擴(kuò)增及鑒定大鼠處死后用75%乙醇浸泡10in。取股骨和脛骨，剔去肌肉組織后用PBS沖洗3次，剪開骨頭兩端，露出骨髓腔。

3、用DE培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，反復(fù)2次。沖洗后的液體過(guò)200目不銹鋼網(wǎng)篩后，按11的體積比加于淋巴細(xì)胞別離液上層以1200r/in離心20in，汲取液面交界處的單個(gè)核細(xì)胞。PBS懸浮細(xì)胞，以200r/in離心6in，反復(fù)2次。吸去上清液后用DE培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為1105/。接種細(xì)胞于塑料培養(yǎng)瓶，每瓶加細(xì)胞懸液5l。接種72h后換液,此后每34d換液1次。待原代細(xì)胞長(zhǎng)至80%瓶底面積時(shí)傳代培養(yǎng),以0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化,1瓶分24瓶的比例傳代培養(yǎng),反復(fù)進(jìn)展擴(kuò)增。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)D44、D34及D45。1.3共培養(yǎng)模型的建立與分組利用復(fù)合培養(yǎng)體系

4、將B和Ss培養(yǎng)在培養(yǎng)液以及其中的大分子蛋白可以互相交流而細(xì)胞間不互相接觸的培養(yǎng)板內(nèi)，其間的隔膜孔徑為0.4。培養(yǎng)上室內(nèi)接種B，培養(yǎng)下室內(nèi)放置經(jīng)處理的蓋玻片并接種Ss。分共培養(yǎng)組、普通培養(yǎng)組2組，每組于同一培養(yǎng)板重復(fù)12孔。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.5軟件進(jìn)展t檢驗(yàn)。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2結(jié)果2.1Ss的形態(tài)學(xué)觀察原代初貼壁的Ss呈成纖維細(xì)胞外觀，貼壁細(xì)胞逐漸呈現(xiàn)集落生長(zhǎng)，原代培養(yǎng)45d，貼壁細(xì)胞開場(chǎng)增殖并向三角形、多角形、梭形等分化，外表顆粒少。68d后，部分區(qū)域形成細(xì)胞團(tuán)簇，細(xì)胞呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞梭形外觀，有較多突起，胞核明顯，呈卵圓形，可見13個(gè)核仁，胞質(zhì)豐富、明晰。生長(zhǎng)期細(xì)胞分裂相

5、多見，細(xì)胞突起互相聯(lián)接。原代培養(yǎng)細(xì)胞密度為1105/l時(shí)，1012d長(zhǎng)滿瓶底。交融成片的細(xì)胞排列有一定的方向性，呈旋渦狀排列，細(xì)胞呈梭形或橢圓形等。傳代細(xì)胞擱置24h迅速貼壁，伸展，細(xì)胞呈均勻生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)更加單一，56d鋪滿瓶底(圖1)。圖1原代Ss形態(tài)學(xué)觀察(40)2.2Ss外表抗原鑒定免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞均一性較好,2代細(xì)胞均一性在90%以上,D34、D45表達(dá)為陰性,D44表達(dá)陽(yáng)性。2.3B的形態(tài)學(xué)觀察原代細(xì)胞培養(yǎng)1d后細(xì)胞貼壁展開，呈多角形，不規(guī)那么，胞核大而清楚，呈圓形或卵圓形，含12個(gè)核仁。培養(yǎng)57d時(shí)細(xì)胞半集合，78d時(shí)細(xì)胞80%集合，12d細(xì)胞重疊生長(zhǎng)，15d細(xì)胞結(jié)節(jié)形成

6、，基質(zhì)堆積，原代培養(yǎng)細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)至20d時(shí)出現(xiàn)不透光的鈣化結(jié)節(jié)。生長(zhǎng)期細(xì)胞分裂相多見，細(xì)胞突起互相連接。集合時(shí)呈鋪路石狀。2.4茜素紅染色及Gris法行骨ALP染色結(jié)果茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)酒紅色，ALP染色可見胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黑色顆?；驂K狀沉淀。2.5效應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果普通培養(yǎng)組骨鈣素含量及鈣化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)分別為0.7590.064;6.604.14,共培養(yǎng)組分別為0.9500.017;29.6011.34。說(shuō)明共培養(yǎng)組骨鈣素表達(dá)量鈣化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)顯著高于普通培養(yǎng)組(P0.05，P0.01)。3討論B來(lái)源于多潛能Ss，B功能活性的改變除了與B數(shù)量、B本身存活期有關(guān)外，前B數(shù)量與功能活性也起到重要作用。Ss具

7、有干細(xì)胞的共性，即具有自我復(fù)制和多向分化才能，在不同條件下可以分別分化為所有中胚層來(lái)源的組織，如B、軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等13，目前已經(jīng)成為最具優(yōu)勢(shì)的組織工程種子細(xì)胞。骨鈣素是近年新發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)4，它由成骨細(xì)胞合成。它是B基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的產(chǎn)物，也是骨形成指標(biāo)之一，在正常的骨形成過(guò)程里，B首先表達(dá)型骨膠原，以構(gòu)成骨基質(zhì)的主要成分，然后開場(chǎng)表達(dá)骨ALP，為礦化做準(zhǔn)備，礦化開場(chǎng)后表達(dá)骨鈣素，骨鈣素的合成受維生素D調(diào)控?？梢姽氢}素是由B合成分泌的一種非膠原蛋白，特異性表示成骨活性，為骨形成的敏感指標(biāo)，是反映骨轉(zhuǎn)換率的特異性指標(biāo)。共培養(yǎng)體系細(xì)胞裂解液中骨鈣素表達(dá)明顯高于單獨(dú)培養(yǎng)組，這說(shuō)明經(jīng)過(guò)共育后Ss向成骨分化增強(qiáng)。本結(jié)果顯示說(shuō)明B對(duì)Ss增殖以及向成骨分化有較強(qiáng)的誘導(dǎo)作用。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)研究59，作者推斷，共培養(yǎng)體系中鈣化結(jié)節(jié)數(shù)增多，與B分泌骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BP)有關(guān)。B可合成、貯存并釋放BP，目前認(rèn)為成骨細(xì)胞BP的含量可反映B的骨形成才能，BP可以誘導(dǎo)血管周圍Ss分化為成骨或成軟骨細(xì)胞，并進(jìn)一步形成骨和軟骨。內(nèi)源性BP為一組分子量不同的復(fù)合物，其生物效應(yīng)比克隆純