酶的作用機(jī)制和酶的調(diào)節(jié)課件

1、酶的作用機(jī)制和酶的調(diào)節(jié)課件酶的作用機(jī)制和酶的調(diào)節(jié)課件內(nèi)容提要酶的活性部位酶催化的獨特性質(zhì)影響酶催化效率的有關(guān)原因酶活性的調(diào)節(jié)同工酶內(nèi)容提要酶的活性部位10.1 酶的活性部位10.1.1 酶活性部位的特點酶分子中直接和底物結(jié)合，并和酶催化作用直接有關(guān)的部位稱為酶的活性部位(active site)或活性中心(active center)10.1 酶的活性部位一般是特異的氨基酸殘基比較集中的區(qū)域，即與酶活力直接相關(guān)的區(qū)域?；钚圆课挥址譃椋?）結(jié)合部位（Binding site） -負(fù)責(zé)與底物 的結(jié)合，決定 酶的專一性。2）催化部位(Catalytic site) -負(fù)責(zé)催化底物鍵的斷裂形成新鍵，決

2、定酶的催化能力。酶的活性部位一般是特異的氨基酸殘基比較集中的區(qū)域，即與酶活力直接相關(guān)的區(qū) 左圖：二氫葉酸還原酶底物結(jié)合部位與兩個底物： NADP+ 四氫葉酸酶的活性部位-結(jié)合部位 左圖：二氫葉酸還原酶底物結(jié)合部位與兩個底物：酶的活性部Gly216Gly226Gly216Ser189Gly226Val216Thr226Ser189酶的底物結(jié)合部位決定酶的專一性酶的活性部位-結(jié)合部位Gly216Gly226Gly216Ser189Gly226Asp 102His 57 右圖：胰凝乳蛋白酶的催化部位（由His 57, Asp 102, Ser 195組成）酶的活性部位-結(jié)合部位Asp 102His

3、57 右圖：胰凝乳蛋白酶的催化部位酶的活性部位的共同點：1）活性部位通常只占整個酶分子體積的1%- 2%。酶分子的催化部位一般只有23個氨 基酸殘基組成。2）酶的活性部位是一個三維實體。3）酶的活性部位并不是和底物的形狀正好互 補的，而是在酶和底物結(jié)合的過程中，底物 分子或酶分子，有時是兩者的構(gòu)象同時發(fā)生 了一定的變化后才互補的。酶的活性部位-結(jié)合部位酶的活性部位的共同點：酶的活性部位-結(jié)合部位4）酶的活性部位是位于酶分子表面的一個裂 縫(crevice)內(nèi)。是相當(dāng)疏水的區(qū)域。在裂 縫內(nèi)底物有效濃度可達(dá)到很高。5）底物通過次級鍵較弱的力結(jié)合到酶上。6）活性部位具有柔性或可運動性。酶的活性部位4

4、）酶的活性部位是位于酶分子表面的一個裂酶的活性部位酶活性部位的特點酶活性部位的特點10.1.2 研究酶活性部位的方法10.1.2.1 酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾法10.1.2 研究酶活性部位的方法選擇一種化合物，當(dāng)其與被研究的酶作用時能專門與活性部位氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)共價結(jié)合，然后將這個帶標(biāo)記化合物的酶水解，肽鍵被打開，但標(biāo)記化合物共價鍵不被打開，因此可以分離得到帶有標(biāo)簽的肽段，即可分析出活性部位的氨基酸殘基。巰基、羥基、咪唑基、氨基、羧基和胍基化學(xué)修飾法有一定的缺陷：化學(xué)修飾有可能使活性部位之外的某個氨基酸殘基的側(cè)鏈改變，而影響酶分子的正常結(jié)構(gòu)，因而導(dǎo)致酶活性的喪失。研究酶活性部位的方法選擇一

5、種化合物，當(dāng)其與被研究的酶作用時能專門與活性部位氨基酸A.非特異性共價修飾化學(xué)試劑已和活性部位基團(tuán)結(jié)合的鑒別：一.酶活力的喪失程度和修飾劑濃度成一定的比例關(guān)系。二. 底物或與活性部位結(jié)合的可逆抑制劑可保 護(hù)共價修飾劑的抑制作用，此法不但可以肯定某種基團(tuán)是必需基團(tuán)，還可以確信此基團(tuán) 位于酶的活性部位。研究酶活性部位的方法A.非特異性共價修飾研究酶活性部位的方法B.特異性共價修飾某一化學(xué)試劑專一地修飾酶活性部位的某一氨基酸殘基，使酶失活。二異丙基氟磷酸(DFP)能專一性地與酶活性部位的絲氨酸殘基的羥基共價結(jié)合，使酶活力喪失。二異丙基磷酰化酶(DIP酶)研究酶活性部位的方法B.特異性共價修飾研究酶活

6、性部位的方法DFP一般不與蛋白質(zhì)反應(yīng)，也不與胰凝乳蛋白酶原和變性的胰凝乳蛋白酶反應(yīng)，它也不和天然胰凝乳蛋白酶活性部位Ser195以外的27個Ser結(jié)合，可見活性部位Ser處于一個特殊的結(jié)構(gòu)中，對DFP敏感。對含有DFP集團(tuán)的片段進(jìn)行分析，不僅知道該酶活性部位附近的氨基酸順序，也可得知DIP標(biāo)記在該酶分子的Ser195殘基上。研究酶活性部位的方法DFP一般不與蛋白質(zhì)反應(yīng)，也不與胰凝乳蛋白酶原和變性的胰凝乳C. 親和標(biāo)記(affinity labeling)法 合成與底物結(jié)構(gòu)相似的共價修飾劑。一.可以較專一地引入酶的活性部位，接近底物結(jié)合位點。二.具有活潑的化學(xué)基團(tuán)可以與活性部位的某一基團(tuán)結(jié)合形成

7、穩(wěn)定的共價鍵。利用酶對底物的特殊親和力將酶加以修飾標(biāo)記，故稱親和標(biāo)記。試劑稱“活性部位指示試劑”。研究酶活性部位的方法C. 親和標(biāo)記(affinity labeling)法 研究胰凝乳蛋白酶對甲苯磺酰L苯丙氨酸乙酯(TPE)是底物對甲苯磺酰L苯丙氨酰氯甲基酮(TPCK)是它的親和試劑可使組氨酸咪唑基烷化。鄒承魯圖p387胰凝乳蛋白酶中科院鄒承魯：科學(xué)家有責(zé)任說明真相科學(xué)道德敗給了廣告中國科學(xué)院資深院士、第三世界科學(xué)院院士，我國著名生物化學(xué)家鄒承魯11月23日凌晨5點在北京逝世，享年83歲。中科院鄒承魯：鄒承魯1923年5月17日生于山東省青島市，祖籍江蘇無錫。1941年，他畢業(yè)于由天津遷到重慶

8、的南開中學(xué)高中部；同年，考入設(shè)在昆明的由北京大學(xué)、清華大學(xué)、南開大學(xué)三校聯(lián)合組成的西南聯(lián)合大學(xué)，就讀于化學(xué)系。1946年，在招考英庚款公費出國留學(xué)生的考試中，他以第一名的優(yōu)異成績被錄取。赴英后，師從英國劍橋大學(xué)著名生物化學(xué)家D基林(Keilin)教授。1951年，鄒承魯獲英國劍橋大學(xué)生物化學(xué)博士學(xué)位。鄒承魯1923年5月17日生于山東省青島市，祖籍江蘇無錫。11951年回國后與王應(yīng)睞及汪靜合作純化了琥珀酸脫氫酶，并發(fā)現(xiàn)其輔基為與蛋白部分共價結(jié)合的FAD。此外，他們對呼吸鏈及其他酶系也進(jìn)行了一系列的工作，為我國酶學(xué)及呼吸鏈的研究奠定了良好基礎(chǔ)。1958年，他參加發(fā)起人工合成胰島素工作，并負(fù)責(zé)胰島

9、素A和B鏈的拆合。這項工作的完成確定了胰島素全合成的路線，為胰島素的人工合成做出了重要貢獻(xiàn)。1951年回國后與王應(yīng)睞及汪靜合作純化了琥珀酸脫氫酶，并發(fā)現(xiàn)10.1.2.2 定點誘變法利用定點突變技術(shù)（site directed mutagenesis）,改變編碼蛋白質(zhì)基因中的DNA序列，研究酶活性部位的氨基酸。10.1.2.2 定點誘變法定點誘變法1987年，Craik將胰蛋白酶Asp102誘變?yōu)锳sn102。酶活性降低5000倍。羧肽酶A中Tyr248原認(rèn)為催化所必須，Tyr248 的密碼子（TAT）Phe (TTT)，kcat 不變，Km高6倍。定點誘變法1987年，Craik將胰蛋白酶As

10、p102誘變10.2 酶催化反應(yīng)的獨特性質(zhì)1）酶反應(yīng)可分成兩類：一類反應(yīng)僅僅涉及到電子的轉(zhuǎn)移，反應(yīng)速率或轉(zhuǎn)換數(shù)在108S-1數(shù)量級；另一類反應(yīng)涉及到電子和質(zhì)子兩者或其他基團(tuán)的轉(zhuǎn)移，反應(yīng)速率在103S-1數(shù)量級。2）酶的催化作用是由氨基酸側(cè)鏈上的功能基團(tuán)和輔酶為媒介的。主要的是His、 Ser、Cys、Lys、Glu和Asp。酶的作用機(jī)制和酶的調(diào)節(jié)課件3）酶催化反應(yīng)的最適pH范圍通常是狹小的。4）與底物相比較，酶分子很大，而活性部位通常只比底物大一點。5）酶除了具有催化反應(yīng)所必須的活性基團(tuán)外，還有別的特性，使反應(yīng)進(jìn)行得更有力。酶催化反應(yīng)的獨特性質(zhì)3）酶催化反應(yīng)的最適pH范圍通常是狹小的。酶催化反

11、應(yīng)的獨特性10.3 影響酶催化效率的有關(guān)因素10.3.1酶和底物的鄰近效應(yīng)與定向效應(yīng)酶和底物復(fù)合物的形成過程既是專一性的識別過程，更重要的是分子間反應(yīng)變?yōu)榉肿觾?nèi)反應(yīng)的過程。10.3 影響酶催化效率的有關(guān)因素酶和底物的鄰近效應(yīng)與定向效應(yīng)鄰近效應(yīng)是指酶與底物結(jié)合形成中間復(fù)合物以后，使底物和底物（如雙分子反應(yīng)）之間，酶的催化基團(tuán)與底物之間結(jié)合于同一分子而使有效濃度得以極大的升高，從而使反應(yīng)速率大大增加的一種反應(yīng)。如乙酸對硝基苯脂以咪唑催化水解的反應(yīng)。底物有效濃度增加24倍，反應(yīng)速率加快24倍。酶和底物的鄰近效應(yīng)與定向效應(yīng)鄰近效應(yīng)是指酶與底物結(jié)合形成中間定向反應(yīng) 是指反應(yīng)物的反應(yīng)基團(tuán)之間和酶的催化基團(tuán)

12、與底物的反應(yīng)基團(tuán)之間的正確取位產(chǎn)生的效應(yīng)。羧基和酯之間，自由度愈小，愈能使他們鄰近，并有一定的取向，反應(yīng)速率就愈大。如鄰羥苯丙酸的內(nèi)酯形成，當(dāng)兩個甲基取代了苯環(huán)鄰近的碳原子上的氫，反應(yīng)速率可提高2.51011。酶和底物的鄰近效應(yīng)與定向效應(yīng)定向反應(yīng) 是指反應(yīng)物的反應(yīng)基團(tuán)之間和酶的催化基團(tuán)與底物的反應(yīng)底物和酶的鄰近效應(yīng)與定向效應(yīng)底物和酶的鄰近效應(yīng)與定向效應(yīng)底物和酶的鄰近效應(yīng)與定向效應(yīng)咪唑催化對-硝基苯酚乙酸酯水解的反應(yīng)：將咪唑和對-硝基苯酚乙酸酯結(jié)合到一個分子上后，反應(yīng)速率增加24倍。底物和酶的鄰近效應(yīng)與定向效應(yīng)10.3.2底物的形變和誘導(dǎo)契合當(dāng)酶遇到其專一性底物時，酶中某些基團(tuán)或離子可以使底物分

13、子內(nèi)敏感鍵中的某些基團(tuán)的電子云密度增高或降低，產(chǎn)生“電子張力”，使敏感鍵的一端更加敏感，底物底物分子發(fā)生形變。底物和酶結(jié)合時構(gòu)象變化示意圖10.3.2底物的形變和誘導(dǎo)契合 誘導(dǎo)契合學(xué)說 （1958， Daniel E. Koshland)： 該學(xué)說認(rèn)為酶表面并沒有一種與底物互補的固定形狀，而只是由于底物的誘導(dǎo)才形成了互補形狀。 誘導(dǎo)契合學(xué)說 （1958， Daniel E. Kos底物的形變和誘導(dǎo)契合底物的形變和誘導(dǎo)契合10.3.3 酸堿催化酸堿催化是通過瞬時的向反應(yīng)物提供質(zhì)子或從反應(yīng)物接受質(zhì)子以穩(wěn)定過渡態(tài)，加速反應(yīng)的一類催化機(jī)制。專一的酸堿催化或狹義的酸堿催化。化學(xué)反應(yīng)無催化劑催化劑（H+）

14、蔗糖水解1339.8 kJ/mol104.7 kJ/mol10.3.3 酸堿催化酸堿催化是通過瞬時的向反應(yīng)物提供質(zhì)總酸堿催化或廣義的酸堿催化。在生理條件下，因H+和OH-的濃度甚低，故體內(nèi)的酶反應(yīng)以總酸堿催化作用較為重要。氨基、羧基、巰基、酚羥基及咪唑基。酸堿催化總酸堿催化或廣義的酸堿催化。酸堿催化酸堿催化His 是酶的酸堿催化作用中最活潑的氨基酸殘基。酸堿催化His 是酶的酸堿催化作用中最活潑的氨基酸殘基。10.3.4 共價催化共價催化又稱親核催化或親電子催化，在催化時，親核催化劑或親電子催化劑能分別放出電子或汲取電子并作用于底物的缺電子中心或負(fù)電中心，迅速形成不穩(wěn)定的共價中間復(fù)合物，降低反

15、應(yīng)活化能，使反應(yīng)加速。10.3.4 共價催化底物中典型的親電中心，包括磷酰基、?；吞腔F(xiàn)已知100多種酶在催化過程中形成共價中間物。底物與酶分子中親核基團(tuán)分別形成酰基絲氨酸、?；腚装彼帷⒘姿峤z氨酸、磷酸組胺酸和西佛堿。共價催化磷酰基?；腔孜镏械湫偷挠H電中心，包括磷酰基、?；吞腔矁r催化磷?；?0.3.5 金屬離子催化1/3的酶催化需要金屬離子：金屬酶：含緊密結(jié)合的金屬離子金屬-激活酶： 含松散結(jié)合的金屬離子10.3.5 金屬離子催化10.3.6 多元催化和協(xié)同效應(yīng)多種作用配合在一起起作用：胰凝乳蛋白酶： Asp102 /His57/Ser159:電荷中繼網(wǎng)（親核催化和堿催化）10.

16、3.6 多元催化和協(xié)同效應(yīng)10.3.7 活性部位微環(huán)境的影響非極性環(huán)境中兩個帶電集團(tuán)之間的靜電作用比在極性環(huán)境中高，疏水微環(huán)境有利于酶的作用。10.3.7 活性部位微環(huán)境的影響10.5 酶活性的調(diào)節(jié)控制別構(gòu)調(diào)節(jié)酶原的激活可逆的共價修飾10.5 酶活性的調(diào)節(jié)控制10.5.1 別構(gòu)調(diào)節(jié)酶分子的非催化部位與某些化合物可逆地非共價地結(jié)合后發(fā)生構(gòu)像的改變，進(jìn)而改變酶的活性狀態(tài)，稱為酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)（allosteric regulation）別構(gòu)酶 （allosteric enzyme）正效應(yīng)物（postitive effector）別構(gòu)激活劑負(fù)效應(yīng)物（negative effector）別構(gòu)抑制劑同促效應(yīng)

17、異促效應(yīng)10.5.1 別構(gòu)調(diào)節(jié) 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶別構(gòu)調(diào)節(jié) 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶別構(gòu)別構(gòu)調(diào)節(jié)別構(gòu)調(diào)節(jié)ATCase 的結(jié)構(gòu)c: 催化肽鏈；r:調(diào)節(jié)肽鏈催化亞基調(diào)節(jié)亞基ATCase 的結(jié)構(gòu)c: 催化肽鏈；r:調(diào)節(jié)肽鏈催化亞基調(diào)節(jié)ATCase 的構(gòu)象改變與底物結(jié)合后，ATCase兩個催化肽鏈的三級與四級結(jié)構(gòu)變化圖解 ATCase 的構(gòu)象改變與底物結(jié)合后，ATCase兩個催化CTP 是酶的抑制劑ATP 是酶的激活劑異促效應(yīng)（heterotropic effect）：非底物分子的調(diào)節(jié)物對別構(gòu)酶的調(diào)節(jié)作用。別構(gòu)調(diào)控CTP 是酶的抑制劑別構(gòu)調(diào)控10.5.1.3 別構(gòu)酶的性質(zhì)一般都是寡聚酶別構(gòu)酶的動力學(xué)協(xié)同指數(shù)

18、(cooperativity index,CI)：鑒別不同的協(xié)同作用及協(xié)同的程度。又稱飽和比值Rs10.5.1.3 別構(gòu)酶的性質(zhì) 位點被90%飽和時的底物濃度CI=Rs= 位點被10%飽和時的底物濃度 =811/nn協(xié)同系數(shù)(Hill系數(shù))米氏類型的酶 Rs=81正協(xié)同效應(yīng)的酶Rs81 位點被90%飽和時的底物濃度別構(gòu)酶的性質(zhì)別構(gòu)酶的性質(zhì)別構(gòu)模型別構(gòu)模型別構(gòu)模型別構(gòu)模型10.5.2 酶原的激活10.5.2.1消化系統(tǒng)蛋白酶原的激活胰凝乳蛋白酶原（紫）與胰凝乳蛋白酶（綠）的構(gòu)象比較10.5.2 酶原的激活胰凝乳蛋白酶原（紫）與胰凝乳蛋白酶酶的作用機(jī)制和酶的調(diào)節(jié)課件酶的作用機(jī)制和酶的調(diào)節(jié)課件10.5.2.2凝血機(jī)制凝血機(jī)制：被傷害的血管收縮以減少血