血管緊張素Ⅱ?qū)δ氀狢D34+細(xì)胞體外分化為巨核細(xì)胞的影響

1、血管告急素對臍血CD34+細(xì)胞體外分化為巨核細(xì)胞的影響戴兵，何吉，陳舒，劉晉輝，秦斐，朱創(chuàng)造，嚴(yán)力行【摘要】為了探究血管告急素對臍血D34+細(xì)胞誘導(dǎo)分化為巨核細(xì)胞的影響，接納免疫磁珠法(AS)分選8例康健產(chǎn)婦足月安產(chǎn)胎兒臍血中的D34+細(xì)胞，在含血小板天生素TP50ng/l、白介素-3IL-310ng/l、干細(xì)胞刺激因子SF50ng/l的無血清造就液中添加濃度別離為50、100、1000g/l的血管告急素作為實行組；同時以未添加血管告急素的底子造就液作為比較組，造就14天后不雅察效果。細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)單個核細(xì)胞數(shù)N；流式細(xì)胞儀計數(shù)造就體系中的D41+細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)，及闡發(fā)細(xì)胞周期；使用D41單

2、克隆抗體免疫熒光染色不雅察造就體系中的細(xì)胞環(huán)境。效果表白：與比較組比力，實行組單個核細(xì)胞數(shù)無顯著改變P0.05；而D41+細(xì)胞和血小板數(shù)目有顯著的增長(P0.05)；細(xì)胞周期闡發(fā)表現(xiàn)，實行組的4倍體細(xì)胞增長，并存在顯著的凋亡(P0.05)；熒光顯微鏡下不雅察比較組和實行組均可見巨細(xì)不一的D41+細(xì)胞。結(jié)論：血管告急素可以促進(jìn)臍血中D34+細(xì)胞誘導(dǎo)分化為巨核細(xì)胞，并能促進(jìn)巨核細(xì)胞產(chǎn)生血小板?！娟P(guān)鍵詞】血管告急素；D34+細(xì)胞；巨核細(xì)胞；臍血EffetfAngitensinnDifferentiatinfUbilialrdBldD34+ellsintegakaryytesKeyrdsangiten

3、sin；D34+ell；egakaryyte；ubilialrdbld血管告急素angitensin，Ang是腎素血管告急素體系的一種重要活性物質(zhì)，其生物學(xué)作用重要是調(diào)治機體內(nèi)水、電解質(zhì)和血壓的平衡，但很多臨床和體外實行效果提示，Ang大概到場調(diào)控造血細(xì)胞的生長。國表里部門學(xué)者研究了Ang對紅系造血的影響1-4，但Ang對巨核系的作用尚不清楚。在本實行中我們接納無血清造就體系體外誘導(dǎo)D34+細(xì)胞擴增，探究Ang對臍血D34+細(xì)胞誘導(dǎo)分化為巨核細(xì)胞和血小板天生的影響。擔(dān)當(dāng)質(zhì)料和要領(lǐng)重要試劑AngAnaSpe，In.產(chǎn)物5g溶解于1l的滅菌雙蒸水中，濃度為5g/l；D34(8G12)-PE、D41

4、a-FIT、D61-PerP和細(xì)胞周期闡發(fā)試劑(yleTESTPlusDNAReagentKit)購自美國BatnDikinsn公司；無血清造就液SteSpanTSFE、血小板天生素TP、白介素-3IL-3、干細(xì)胞因子SF購自加拿大Steell公司。臍血的網(wǎng)羅和單個核細(xì)胞分散選擇正常臨盆的康健產(chǎn)婦8名，征得其同意后于足月安產(chǎn)的胎兒娩出后立即斷臍，消毒臍帶外貌，行臍靜脈穿刺，用AD-B三聯(lián)袋山東威高團(tuán)體產(chǎn)物網(wǎng)羅臍血。接納淋巴細(xì)胞分散液分散單個核細(xì)胞N，從標(biāo)本網(wǎng)羅隨處置懲罰不凌駕12小時。D34+細(xì)胞的分選接納吸附單克隆抗體-磁珠分散體系A(chǔ)S，德國iltenyi公司產(chǎn)物分散富集D34+細(xì)胞，分散后

5、的D34+細(xì)胞在流式細(xì)胞儀FASalibur，美國BetnDikinsn公司產(chǎn)物上檢測其純度為86-91。D34+細(xì)胞體外誘導(dǎo)造就在SteSpanTSFE無血清造就液中參加TP50ng/l、IL-310ng/l、SF50ng/l作為底子造就體系比較組。在上述底子造就體系中別離添加終濃度為50、100、1000g/l的Ang作為試驗組。調(diào)解D34+細(xì)胞終濃度為1105/l，接種在24孔板上，每孔1l，在37、5%2、飽和濕度條件下造就14天。N計數(shù)造就14天后的細(xì)胞，接納細(xì)胞計數(shù)儀雅培ell-Dyn1700檢測其N數(shù)。D34+細(xì)胞、D41+細(xì)胞檢測及細(xì)胞周期闡發(fā)造就14天后的細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀別

6、離檢測其D34+細(xì)胞、D41+細(xì)胞和闡發(fā)細(xì)胞周期，操縱均嚴(yán)酷按試劑說明書舉行。造就細(xì)胞熒光染色造就14天后的細(xì)胞，經(jīng)離心洗滌后涂片、甲醛結(jié)實。在涂片上滴加FIT250g/l標(biāo)識表記標(biāo)幟的抗D41單克隆抗體，37孵育30分鐘，洗滌印干，立即在熒光顯微鏡下不雅察效果。血小板的檢測血小板為D41+細(xì)胞，其體積遠(yuǎn)小于巨核細(xì)胞，胞內(nèi)所含顆粒比平凡細(xì)胞少。按照此特性在流式細(xì)胞儀上使用側(cè)向角SS不雅察血小板。統(tǒng)計學(xué)處置懲罰接納SPSS12.0統(tǒng)計軟件包處置懲罰數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)效果以XSD表現(xiàn)，組間計量資料比力接納t查驗。效果差異濃度Ang對臍血D34+細(xì)胞造就后N和D41+細(xì)胞數(shù)的影響效果表現(xiàn)，實行組和比較組D4

7、1+細(xì)胞數(shù)均增長，但各Ang濃度實行組的D41+細(xì)胞數(shù)均顯著高于比較組P0.05表1，造就后各組的N總數(shù)無明顯性差異P0.05。Table1.EffetfAngindifferentnentratinsnnuberfNandD41+ells(略)Ang對臍血D34+細(xì)胞造就后細(xì)胞周期的影響接納流式細(xì)胞儀闡發(fā)細(xì)胞周期。效果表現(xiàn)，比較組大多為2倍體細(xì)胞，存在少量的4倍體細(xì)胞；而實行組G2/期細(xì)胞比例顯著增長表2，同時可見顯著亞二倍體峰和4倍體細(xì)胞峰。Table2.Analysisfellylebyflytetry(略)造就后細(xì)胞抗D41單克隆抗體熒光染色效果熒光顯微鏡下可見部門細(xì)胞的胞膜上表現(xiàn)清楚

8、的綠色熒光，細(xì)胞體積巨細(xì)不一2-5、10-15，圓形或橢圓形。這提示造就后的細(xì)胞中含有巨核細(xì)胞和血小板圖1。Figure1.Fluresenestainingftreatedellsinulturebyanti-huanD41-FITantibdy.(400).Ang對臍血D34+細(xì)胞造就14天后血小板天生量的影響用正常成人外周血液中富集得到的血小板校準(zhǔn)儀器后，在流式細(xì)胞儀上闡發(fā)造就14天后的細(xì)胞可見實行組血小板峰顯著高于比較組圖2。討論比年來創(chuàng)造，巨核祖細(xì)胞體外擴增得到的巨核細(xì)胞輸注到病人體內(nèi)后，能在體內(nèi)進(jìn)一步發(fā)育并形成血小板，加快病人血小板的規(guī)復(fù)，收縮血小板缺乏期5。因此體系研究體外造血細(xì)

9、胞向巨核系定向誘導(dǎo)分化和擴增具有緊張的意義，它將為化療或移植后的血小板淘汰癥提供一個大概的治療途徑。現(xiàn)有研究表白，體外巨核祖細(xì)胞的擴增和分化受多種細(xì)胞因子的調(diào)治6，7，此中最關(guān)鍵的因子是TP，本實行室和其他作者曾證明G-SF可促進(jìn)巨核細(xì)胞的生長分化8。由于到場造血調(diào)控的因素較多，比年來研究者開始存眷機體其他體系的生物活性因子對造血體系的影響。Rdgers等1報道，Ang可以刺激早期干細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其向原始紅細(xì)胞分化。黎緯明等3創(chuàng)造，Ang對D34+細(xì)胞階段的造血干/祖細(xì)胞無直接的生長調(diào)治作用，但在造血干/祖細(xì)胞生長分化的歷程中，可刺激FU-G和BFU-E的增生。彭程等4創(chuàng)造Ang可刺激FU

10、G和其進(jìn)一步分化細(xì)胞的擴增。本實行在TP、IL-3、SF因子組合的底子上不雅察Ang對臍血D34+細(xì)誘導(dǎo)分化成巨核細(xì)胞的作用。效果表白，Ang可以促進(jìn)臍血中D34+細(xì)胞誘導(dǎo)分化為巨核細(xì)胞，并能增強巨核細(xì)胞的成熟，促進(jìn)巨核細(xì)胞產(chǎn)生血小板。D41分子是巨核細(xì)胞和血小板的特異性外貌標(biāo)識表記標(biāo)幟，本實行中我們使用其斷定巨核細(xì)胞和血小板，效果表現(xiàn)實行組D41+細(xì)胞數(shù)顯著增長，在免疫熒光顯微鏡下也可見巨核細(xì)胞和血小板。巨核系只有在祖細(xì)胞階段才氣舉行擴增從而使巨核細(xì)胞數(shù)目增長，提示Ang一定直接作用于巨核祖細(xì)胞，才氣使巨核細(xì)胞增長，并促進(jìn)巨核細(xì)胞的成熟。Stephane等9報道，半胱天冬酶調(diào)治的細(xì)胞凋亡與巨核細(xì)胞產(chǎn)生血小板有非常嚴(yán)密的接洽，本實行也創(chuàng)造在Ang的作用下，造就后的細(xì)胞出現(xiàn)顯著的亞二倍體峰，提示細(xì)胞的凋亡大概與Ang促進(jìn)巨核細(xì)胞產(chǎn)生血小板有關(guān)。別的，巨核細(xì)胞的核內(nèi)復(fù)制是巨核細(xì)胞走向成熟的歷程，與血小板的產(chǎn)生也嚴(yán)密相干10，2倍體巨核細(xì)胞不產(chǎn)生血小板，只有多倍體巨核細(xì)胞才具備產(chǎn)生血小板的成效。從16倍體到32或64倍體的歷程是巨核細(xì)胞趨于成熟的歷程，由于不雅察時間不敷或必要追加其他刺激巨核系成熟的因子等緣故原由，本實行的造就體系中只不雅察到4倍體細(xì)胞，未能檢測到16倍體、32倍體的成熟巨核細(xì)胞，如安在體外獵取大量的趨多倍體成熟巨核細(xì)胞仍有待于進(jìn)