微生物學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)：支原體、衣原體的檢測(cè)

1、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：支原體、衣原體的檢測(cè)沒有細(xì)胞壁的原核細(xì)胞型微生物呈高度多形性細(xì)胞膜含固醇能通過(guò)0.45m濾菌器二分裂繁殖，含DNA與RNA能在無(wú)生命培養(yǎng)基中繁殖的最小微生物 支原體 (Mycoplasma)營(yíng)養(yǎng)要求較高，培養(yǎng)需加入10%-20%的血清在pH7.88.0間生長(zhǎng)，低于7.0則死亡（解脲脲原體pH6.06.5）生長(zhǎng)緩慢典型的菌落呈荷包蛋樣液體培養(yǎng)基不易見到混濁是引起細(xì)胞培養(yǎng)污染的一個(gè)重要因素Mycoplasma infection in cell culture 無(wú)細(xì)胞壁高度多形性對(duì)作用于細(xì)胞壁上的藥物均耐藥可通過(guò)濾菌器培養(yǎng)條件相似（高滲）支原體與細(xì)菌L型的共性細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖結(jié)構(gòu)受到理

2、化或生物因素的直接破壞或合成被抑制，這種細(xì)胞壁受損的細(xì)菌一般在普通環(huán)境中不能耐受菌體內(nèi)的高滲透壓而脹裂死亡。這種細(xì)胞壁受損的細(xì)菌能夠生長(zhǎng)和分裂者稱為細(xì)菌細(xì)胞壁缺陷型或細(xì)菌L型（L form） 支原體與細(xì)菌L型的區(qū)別 支原體 L型 在遺傳上與細(xì)菌無(wú)關(guān) 與原菌相關(guān)，常可以回復(fù) 細(xì)胞膜含高濃度固醇 細(xì)胞膜不含固醇 生長(zhǎng)慢，菌落小， 菌落稍大， 液體培養(yǎng)混濁度極低 液體培養(yǎng)有一定混濁度主要致病性支原體（一）肺炎支原體原發(fā)性非典型肺炎primary atypical pneumonia（間質(zhì)性肺炎）占非細(xì)菌性肺炎的三分之一以上飛沫傳播，夏末秋初為好發(fā)季節(jié)癥狀較輕，發(fā)熱、咳嗽、與感冒癥狀相似，有時(shí)有呼吸道

3、外并發(fā)癥（二）泌尿生殖道感染支原體解脲脲原體、人型支原體傳播途徑：性傳播、垂直傳播非淋菌性尿道炎自然流產(chǎn)、出生缺陷、死胎、不孕（育）（三）穿透支原體穿透支原體是1990年首次從1例HIV陽(yáng)性艾滋病患者尿中分離出的一種新支原體 穿透支原體感染 是艾滋病的輔助致病因素 嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生 有獨(dú)特發(fā)育周期 能通過(guò)濾菌器 原核細(xì)胞型微生物 衣原體 Chlamydia革蘭陰性，圓形或橢圓形體；具有細(xì)胞壁，其組成與革蘭陰性菌相似；有獨(dú)特的發(fā)育周期，行二分裂方式繁殖；有核糖體和較復(fù)雜的酶類，但缺乏供代謝所需的能量來(lái)源，營(yíng)專性細(xì)胞內(nèi)寄生 對(duì)多種抗生素敏感 獨(dú)特的發(fā)育周期 原體（elementary body，EB

4、） 始體（initial body）生物學(xué)性狀原體（elementary body, EB）始體（initial body）網(wǎng)狀體（reticulate body, RB） 小 大有致密的類核結(jié)構(gòu)，有胞壁，發(fā)育成熟體大，電子致密度較低，無(wú)胞壁Giemsa 紫色，Macchiavello 紅色Macchiavello 藍(lán)色高度感染性（有毒性）無(wú)感染性（無(wú)毒性）無(wú)繁殖能力代謝活潑，以二分裂方式繁殖胞外穩(wěn)定性強(qiáng)胞外穩(wěn)定性弱 包涵體含糖原，被碘液染為棕褐色實(shí)驗(yàn)內(nèi)容支原體培養(yǎng)、鑒定藥敏沙眼衣原體抗原檢測(cè)（膠體金法）支原體培養(yǎng)、鑒定藥敏本試劑盒適用于解脲支原體（Uu）、人型支原體（Mh）原理： 當(dāng)Uu和M

5、h生長(zhǎng)時(shí)，尿素和精氨酸分解生成的堿性物質(zhì)引起pH上値上升，培養(yǎng)基由黃色變成紅色。培養(yǎng)基內(nèi)加抑菌劑，可抑制生殖道中的細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)。培養(yǎng)基：支原體基礎(chǔ)肉湯、馬血清、混合抗生素、生長(zhǎng)因子、尿素、精氨酸、酚紅指示劑等。標(biāo)本采集男性：用無(wú)菌棉拭子插入尿道約2cm處旋轉(zhuǎn)，靜止數(shù)秒鐘后取材。女性：支原體標(biāo)本抹去宮頸口粘液，用無(wú)菌拭子插入宮頸管l2cm旋轉(zhuǎn)取材。尚可用前列腺液、精液、尿液離心沉淀物作標(biāo)本。支原體對(duì)細(xì)胞表面有很強(qiáng)的親和力，應(yīng)盡可能多采集細(xì)胞。檢測(cè)方法取所需數(shù)量試劑復(fù)溫至室溫，編號(hào)后，將沒接種標(biāo)本前培養(yǎng)基取100ul加入A1孔，設(shè)為陰性對(duì)照接種標(biāo)本：棉拭子插入培養(yǎng)液中充分振洗并在瓶壁擠干拭子；

6、液態(tài)標(biāo)本取150-200ul于培養(yǎng)基中搖勻。將混有標(biāo)本的培養(yǎng)基100ul加入除A1外的各微孔中。加礦物油1滴覆蓋。置培養(yǎng)藥敏板于37培養(yǎng)，24h和48h分別觀察記錄結(jié)果。按結(jié)果填寫報(bào)告單。結(jié)果解釋1、陰陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：黃色或橙黃色陰性（-）；清晰透明紅色陽(yáng)性（+）；渾濁紅色：污染。2、A1孔（陰性對(duì)照孔）應(yīng)為陰性，若為陽(yáng)性表示有污染，本次試驗(yàn)無(wú)效。3、A2孔（+）：僅A2孔變紅，表示有支原體生長(zhǎng)，半定量計(jì)數(shù)104ccu，如果每份標(biāo)本濃度 104ccu，B排第1、2孔（B1，B2)微管就會(huì)發(fā)生顏色變化。Uu：在24h記錄結(jié)果Mh：在48h后記錄結(jié)果4、B1孔（+）：解脲支原體陽(yáng)性，Uu 104

7、ccu； B2孔（+）：人型支原體陽(yáng)性，Mh 104ccu5、藥敏試驗(yàn)結(jié)果的判斷 藥敏孔變紅，表示孔中有Uu或者M(jìn)h生長(zhǎng)，顯示支原體對(duì)該種抗生素耐藥或中度敏感，反之則敏感。A3-A14，B3-B14 相成對(duì)表示藥物的高低濃度。H（即A排）：高濃度藥敏孔L（即B排）：低濃度藥敏孔An（-）Bn（-）：敏感An（-）Bn（+）：中敏An（+）Bn（+）：耐藥ECC 環(huán)酯紅霉素DOX 強(qiáng)力霉素JOS 交沙霉素THI 甲砜霉素CLA 克拉霉素ERY 紅霉素CPF 環(huán)丙沙星ROX 羅紅霉素CRA 可樂必妥MIN 美滿霉素AZI 阿奇霉素GAT 加替沙星注意事項(xiàng)培養(yǎng)基接種到藥敏板前要充分混勻培養(yǎng)基變紅，但

8、渾濁，不能報(bào)陽(yáng)性，或重做實(shí)驗(yàn)因?yàn)榇蟛糠謽?biāo)本是不可溶性物質(zhì)，可能導(dǎo)致藥敏板上微孔接種量不均一，導(dǎo)致藥敏結(jié)果不合理，此時(shí)，請(qǐng)棄用此種藥物。沙眼衣原體抗原檢測(cè)（膠體金法）原理： 用抗衣原體脂多糖單克隆抗體和羊抗鼠IgG多克隆抗體分別固定于固相硝酸纖維素膜，并和膠體金標(biāo)記的另一抗衣原體脂多糖單克隆抗體及其他試劑和原料制成，應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)，采用雙抗體夾心的形式建立的衣原體檢測(cè)方法。操作步驟將樣品處理管放在工作臺(tái)上，加入6滴溶液A將采樣拭子放入含有溶液A的樣品處理管中，室溫放置，在處理過(guò)程中不斷旋轉(zhuǎn)并在管壁擠壓拭子，使液體不斷被擠出，重復(fù)多次，處理2分鐘。加入6滴溶液B，旋轉(zhuǎn)并擠壓拭子，充分混勻后滴2-3滴在檢測(cè)試劑盒的加樣孔中，然后等待結(jié)果10min內(nèi)完成結(jié)果的判讀試劑組成沙眼衣原體抗原快速檢測(cè)試劑卡： 包被有抗衣原體脂多糖單克隆抗體-I、抗衣原體脂多糖單克隆抗體-II和羊抗鼠IgG試紙條溶液A：NaOH溶液溶液B：HCl溶液樣品處理管參考范圍本產(chǎn)品對(duì)E型沙眼衣原體最低檢出量為4*103IFU/ml，檢測(cè)結(jié)果 4*103IFU/ml為陽(yáng)性， 4*103IFU/ml為陰性【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】陰