免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)血清學(xué)反應(yīng)

1、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)血清學(xué)反應(yīng)【基本要求】1. 上實(shí)驗(yàn)課時(shí)，把個(gè)人的書包和衣物放在衣柜內(nèi)，穿好白大衣。隨身只帶必要的實(shí)習(xí)指導(dǎo)、筆記本和文具。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)禁止飲食。2. 用過的實(shí)驗(yàn)材料，放于指定地點(diǎn)，不得隨意拋置。3. 注意節(jié)約實(shí)驗(yàn)試劑，愛護(hù)實(shí)驗(yàn)器材。損壞器材時(shí)，應(yīng)立即報(bào)告指導(dǎo)教師，聽候處理。4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將實(shí)驗(yàn)臺(tái)整理清潔，方可離開實(shí)驗(yàn)室。值日同學(xué)打掃好室內(nèi)衛(wèi)生并檢查水、電、等開關(guān)是否關(guān)好，防止意外事故發(fā)生。2 指抗原Ag與相應(yīng)抗體Ab之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)?？砂l(fā)生于體內(nèi)，也可發(fā)生于體外。 3解離Ag + AbAg Ab一定條件（動(dòng)態(tài)平衡）一、抗原抗體反應(yīng)的定義及用途體內(nèi)反應(yīng)可介導(dǎo)殺菌、溶菌、調(diào)理、中

2、和毒素等作用免疫病理?yè)p傷超敏反應(yīng)、免疫性疾病等43D模型 IgG1Ig：存在于血清（占血清免疫球蛋白總量的80%）和組織液中。5IgAIgM二、血清學(xué)反應(yīng)的特點(diǎn)：1、特異性：抗原抗體在體外的結(jié)合與在體內(nèi)一樣，也具有專一性，即特異性。6分子基礎(chǔ)：Ag-ADHVR-Ab空間結(jié)構(gòu)高度互補(bǔ)VH和VL各具三個(gè)HVR與AD互補(bǔ)應(yīng)用： 由于抗原抗體反應(yīng)具有高度特異性，故可用已知的抗原（抗體）來檢測(cè)相應(yīng)未知的抗體（或抗原）。2、可逆性：抗原與抗體的結(jié)合是非共價(jià)鍵結(jié)合，在一定條件下又可解離為游離狀態(tài)，反應(yīng)具有可逆性。7靜電引力（electrostatic forces）范德華引力:作用最?。╲an der Wa

3、als interactions）氫鍵:最具特異性（hydrogen bond ）疏水作用力:作用最大 （hydrophobic interactions） 3、可見性：反應(yīng)體系中抗原抗體的比例適當(dāng)，就能形成較大的抗原抗體復(fù)合物，在有一定量電解質(zhì)或適宜pH等條件下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集、沉淀等可見反應(yīng)。89親水膠體疏水膠體轉(zhuǎn)化NaCl可見反應(yīng)血清學(xué)反應(yīng)條件下，抗原抗體均帶負(fù)電荷，使極化的水分子在其周圍形成水化層，成為親水膠體。 當(dāng)抗原與抗體結(jié)合使表面電荷減少，水化層變薄，失去親水性能，抗原抗體復(fù)合物成為疏水膠體在電解質(zhì)作用下，中和膠體粒子表面的電荷，使各疏水膠體之間靠攏，形成可見的抗原抗體復(fù)合物

4、親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體4、階段性：抗原抗體反應(yīng)分兩個(gè)階段：抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合的階段，反應(yīng)快，幾秒或幾分鐘，不可見可見階段，短至數(shù)分、數(shù)小時(shí)，長(zhǎng)至數(shù)日，出現(xiàn)凝集、 沉淀和細(xì)胞溶解等現(xiàn)象 10概念：兩種不同的抗原分子具有部分相同或類似結(jié)構(gòu)的抗原表位，可與彼此相應(yīng)的抗血清發(fā)生反應(yīng)。交叉反應(yīng)（cross reactions）抗原抗體交叉反應(yīng)示意圖B親緣關(guān)系越近，交叉反應(yīng)的程度也越高 11三、血清學(xué)反應(yīng)的影響因素121、反應(yīng)物自身因素 *抗原：理化特性、Ag決定簇?cái)?shù)量和種類。 *抗體：1、來源 2、特異性與親和力 3、濃度 比例要合適13（1）電解質(zhì) 作用：中和膠體表面電荷，破壞水化層， 使AgAb

5、聚集。 常用：0.85%NaCl溶液、緩沖液、Ca2+、Mg2+等。 注意：鹽析（salting）即電解質(zhì)濃度過高 引起的非特異性蛋白質(zhì)沉淀。2、環(huán)境因素：（2）酸堿度Ag、Ab多為蛋白質(zhì)，具兩性電離特性，有其故有的PI , pH過高或過低均可影響Ag、Ab反應(yīng)。一般：pH68為宜，補(bǔ)體參與時(shí)。注意：自凝現(xiàn)象-即pH達(dá)到或接近顆粒性抗原的PI時(shí)，引起的抗原非特異性自身凝集現(xiàn)象。（3）溫度影響反應(yīng)速度一般：1540 為宜，最適溫度：37過高（56）: Ag-Ab解離， Ag、Ab變性， 補(bǔ)體失活。冷凝集實(shí)驗(yàn)：4 凝集，20解離。（4）其他 適當(dāng)?shù)恼袷?、攪拌等可加速反?yīng)抗體的兩個(gè)Fab段分別結(jié)合兩

6、個(gè)Ag分子，相互交叉結(jié)合連接成巨大的網(wǎng)格狀立體聚合物，（可見）。 Ab/Ag過剩過剩方的結(jié)合價(jià)得不到飽和，大多數(shù)游離存在，只形成小分子復(fù)合物（不可見）。只有抗原與抗體呈適當(dāng)比例時(shí)，才可出現(xiàn)可見的結(jié)合反應(yīng)。17四、傳統(tǒng)的血清學(xué)反應(yīng)1、凝集反應(yīng)2、沉淀反應(yīng)3、補(bǔ)體參與的溶血反應(yīng)4、中和試驗(yàn)（一）凝集反應(yīng)1、定義：顆粒性抗原（如細(xì)菌、紅血球等） +抗體凝集現(xiàn)象。顆粒性抗原與相應(yīng)的抗體在體外結(jié)合，在電解質(zhì)存在的條件下，形成肉眼可見凝集塊，為凝集反應(yīng)，反應(yīng)中的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。182、分類（1）直接凝集反應(yīng)概念：天然的凝集原與相應(yīng)抗體直接結(jié)合呈現(xiàn)的細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象稱為直接凝集反應(yīng)。

7、應(yīng)用：定性檢測(cè)ABO血型鑒定、細(xì)菌鑒定定量檢測(cè)診斷傷寒病的肥達(dá)試驗(yàn)等1920血型鑒定（2）間接凝集反應(yīng)（3）間接凝集抑制試驗(yàn)21（二）沉淀反應(yīng)1、概念：可溶性抗原+抗體沉淀現(xiàn)象。 可溶性抗原（如細(xì)菌的外毒素、內(nèi)毒素、菌體裂解液、病毒的可溶性抗原、血清、組織浸出液等）與相應(yīng)的抗體結(jié)合，在適量電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的細(xì)微的白色沉淀。22232、分類 （1）液相中的沉淀反應(yīng)： 環(huán)狀沉淀、絮狀沉淀（2）凝膠擴(kuò)散： 單向擴(kuò)散：1%瓊脂凝膠的孔徑約85納米，可允許各種Ag或Ab自由擴(kuò)散，由近及遠(yuǎn)形成濃度梯度。24通過標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 不同病人抗原濃度測(cè)定1.測(cè)定沉淀環(huán)直徑2.在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找相應(yīng)抗原

8、濃度火箭免疫電泳火箭免疫電泳是單向單擴(kuò)散和電泳技術(shù)相結(jié)合的一種血清學(xué)試驗(yàn)，是讓抗原在電場(chǎng)的作用下，在含有抗體的瓊脂中定向泳動(dòng)，二者比例合適時(shí)形成類似火箭樣的沉淀峰。沉淀峰的高度與抗原的濃度成正比 。25電泳完畢后，觀察瓊脂板上沉淀峰，并測(cè)量從孔中心到峰尖的高度。以峰高為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo))，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待檢樣品內(nèi)抗原濃度26 可溶性抗原與相應(yīng)抗體在含適量電解質(zhì)的瓊脂糖凝膠板的對(duì)應(yīng)孔中各自向四周自由擴(kuò)散,若兩者分子比例適當(dāng),則在擴(kuò)散的一定時(shí)間后在兩孔之間相遇并生成白色沉淀線.雙向擴(kuò)散：(1) 沉淀線吻合：待檢抗原與標(biāo)準(zhǔn)抗原完全相同。(2) 沉淀線相切：待檢抗原中含有與標(biāo)準(zhǔn)抗原相

9、同的抗原，還含有另外的抗原與抗血清相對(duì)應(yīng)。(3) 沉淀線相交：待檢抗原有與抗血清對(duì)應(yīng)的抗原，但和標(biāo)準(zhǔn)抗原不同。(4) 沉淀線部分吻合：待測(cè)抗原和標(biāo)準(zhǔn)抗原性質(zhì)相同，但含量較低。A1：待檢抗原；A2：標(biāo)準(zhǔn)抗原27免疫電泳對(duì)流免疫電泳28在的瓊脂凝膠中，抗體球蛋白泳向負(fù)極；而一般抗原蛋白質(zhì)泳向正極抗原和抗體將在兩孔之間相遇，（三）中和反應(yīng)：特異性抗體抑制多種抗原的生物學(xué)活性（細(xì)菌外毒素的毒性、酶的活性、病毒的感染性等）的反應(yīng)。主要用于毒素的鑒定、病毒感染性疾病的診斷以及病毒的鑒定。例如在臨床實(shí)驗(yàn)診斷中測(cè)定風(fēng)濕病患者體內(nèi)的抗鏈球菌 O抗體的反應(yīng)。2930（四）補(bǔ)體溶血：紅細(xì)胞與相應(yīng)抗體結(jié)合，可激活補(bǔ)體

10、使紅細(xì)胞溶解，稱為補(bǔ)體溶血反應(yīng)或免疫溶血反應(yīng)。原理：補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑（補(bǔ)體的動(dòng)畫）補(bǔ)體特點(diǎn)：補(bǔ)體可與任何抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，但不能單獨(dú)與抗原或抗體結(jié)合。在有特異抗體存在時(shí)可以溶解細(xì)胞（溶菌或溶血）。31溶血反應(yīng)RBC+ RBC抗體 (溶血素)新鮮血清（補(bǔ)體）溶血由抗原抗體復(fù)合物結(jié)合C1q啟動(dòng)的途徑 1. 激活劑 Ag-Ab復(fù)合物(IgG1,IgG2,IgG3,IgM) 2. 參與成分 C1C9 3. 激活過程（三個(gè)階段） 識(shí)別階段 活化階段 膜攻擊階段 35五、現(xiàn)代免疫標(biāo)記技術(shù) 免疫標(biāo)記技術(shù)(Immuno-labelling technique)是指將抗原或抗體用熒光素、酶、放射性同位素和電

11、子致密物質(zhì)等加以標(biāo)記，借以提高其靈敏度的一類新技術(shù)。 優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣、反應(yīng)速度快、容易觀察、能定位、定量甚至定位。1、酶免疫測(cè)定（Enzyme immunoassay,EIA)用酶標(biāo)記的抗體或抗抗體來進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。用酶作標(biāo)記物由于酶的催化作用可使原來無色的底物通過水解、氧化或還原反應(yīng)而顯示顏色。37原理（以間接性ELISA為例）：顯色2、放射免疫測(cè)定法（RIA）：383、免疫熒光技術(shù)3940直接凝集試驗(yàn)雙向擴(kuò)散試驗(yàn)補(bǔ)體溶血試驗(yàn)觀看細(xì)胞免疫的示教片實(shí)驗(yàn)內(nèi)容一、直接凝集試驗(yàn)試管法（1份/人）試管法凝集試驗(yàn)是一種半定量的試驗(yàn)方法，是在試管內(nèi)將抗原或抗體稀釋不同倍數(shù)后加入等

12、量的待檢抗體或抗原，根據(jù)每管內(nèi)的凝集程度，判定待檢樣品中相應(yīng)抗原或抗體的有無及其效價(jià)。試驗(yàn)中可能由于電解質(zhì)濃度或pH 值不適宜等原因，而引起抗原非特異性凝集，出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，所以應(yīng)設(shè)立陰性對(duì)照管。41教材P29942材料：1% 新鮮綿羊紅細(xì)胞懸液、羊紅細(xì)胞凝集素（兔抗綿羊紅細(xì)胞免疫血清）等方法：（理解對(duì)倍稀釋法）1. 取小試管7支，置于試管架上，編號(hào)。2. 用 1ml 刻度吸管吸生理鹽水，第一管加，其余管各加。3. 用 1ml 刻度吸管吸取兔抗羊紅細(xì)胞血清0.1ml 加入第一管 中，反復(fù)吹吸三次，使之與鹽水混勻，吸出注入第二管。同樣混勻后吸取0.5ml 注入第三管，依此類推。自第6管吸出0.5

13、ml 棄掉。第八管不加血清作為對(duì)照。此時(shí)自第一管至第七管血清的稀釋倍數(shù)分別是1:10，1:20，1:401:320，具體稀釋方法可參閱下圖。43血清稀釋度 1：10 1：20 1：40 1：80 1：160 1：320棄之生理鹽水.血清.ml.4. 各管加入綿羊紅細(xì)胞懸液 ，于是各管血清稀釋倍數(shù)又增加了一倍。5. 將各管震蕩均勻，放入37溫箱中過夜，次日觀察結(jié)果。.二、雙向擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)血清中的AFP（1份/2人）【操作方法】1. 雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)抗原抗體孔位置如下圖所示2. 用微量加樣器孔中分別加抗甲胎蛋白診斷血清，周圍孔 中分別加入待測(cè)血清和陽性對(duì)照血清，每孔加入25-30l。3. 將瓊脂板

14、放入密閉的盒內(nèi)（內(nèi)放浸有5%石炭酸的紗布以保持濕度），置37溫箱中，于24小時(shí)后觀察結(jié)果。44注意：加樣量力求準(zhǔn)確，勿使樣品外溢或在孔緣上殘存小汽泡，以免影響擴(kuò)散結(jié)果。原則：滿而不溢44待測(cè)1AFP-AgAFP-Ab待測(cè)2定位標(biāo)記孔45免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 二 續(xù)血清學(xué)反應(yīng)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室一、分析上次結(jié)果（一）血球凝集（直接凝集試管法）：觀察結(jié)果并分析461、從溫箱中輕輕取出試管架，不要搖動(dòng)試管。先觀察對(duì)照管（第7管），此管血球不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，紅細(xì)胞在管底自然沉降呈現(xiàn)點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，上層液基本清澈透亮，管底可見紅細(xì)胞沉積物，呈圓形，邊緣整齊，輕輕振搖試管后，可見紅細(xì)胞浮起又分散仍呈懸液。2、試驗(yàn)管從第一

15、管看起，管底有凝集塊，邊緣不整或卷起等現(xiàn)象，均為陽性反應(yīng)，分別用（+）、（+）、（+）、（+）表示凝集程度。（+）表示血球100% 凝集，紅細(xì)胞形成片層凝集，均勻布滿管底或邊緣皺縮如花環(huán)狀；（+）表示血球75% 凝集，紅細(xì)胞形成片層凝集，面積略多于（+）；（+）表示血球50% 凝集，紅細(xì)胞形成片層凝集，面積較小，邊緣較松散；（+）表示血球25%凝集，紅細(xì)胞沉于管底，周圍有散在的少量凝集。473. 按下列標(biāo)準(zhǔn)判定，記錄結(jié)果。+：凝集特別顯著，紅細(xì)胞均勻地鋪于管底，呈一薄層邊緣有折迭狀。+：凝集顯著，紅細(xì)胞均勻地鋪于管底呈一薄層，但周邊紅細(xì)胞凝集較疏松。+：凝集清楚可見，紅細(xì)胞平鋪于管底呈一薄層，

16、中央可明顯見到一疏松的紅點(diǎn)。+：紅細(xì)胞大部分沉集于管底成圓點(diǎn)狀，周圍有少量凝集的紅細(xì)胞。：紅細(xì)胞全部沉集于管底呈圓點(diǎn)狀，四周液體清晰。4. 判斷效價(jià)：能見到明顯凝集現(xiàn)象（+）的血清最高稀釋度為該血清對(duì)1%綿羊紅細(xì)胞的凝集效價(jià)（或滴度）。一般以出現(xiàn) + 凝集反應(yīng)的最高血清稀釋倍數(shù)作為血清中所含凝集抗體的效價(jià)。48（二）雙向擴(kuò)散（沉淀反應(yīng)）：觀察結(jié)果并分析觀察各孔之間有無白色沉淀線，根據(jù)他們的關(guān)系判斷結(jié)果。在兩孔之間出現(xiàn)一清晰致密白色的沉淀線（抗原抗體復(fù)合物）為陽性反應(yīng)。若72 小時(shí)后仍未出現(xiàn)沉淀線則為陰性反應(yīng)。試驗(yàn)時(shí)陽性對(duì)照與待測(cè)血清兩者沉淀線發(fā)生吻合時(shí)，才能確定待測(cè)血清中含有甲胎蛋白。49三、

17、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（一）補(bǔ)體溶血試驗(yàn)（1份/4人）試劑：2% 綿羊紅細(xì)胞、 溶血素（兔抗綿羊紅細(xì)胞免疫血清）、 補(bǔ)體（新鮮豚鼠血清）綿羊紅細(xì)胞用前應(yīng)輕晃混勻，不可劇烈震蕩5051成分管號(hào)1%SRBC羊溶血素(2單位)補(bǔ) 體(2單位)生理鹽水結(jié)果10.50.50.50.520.50.51.030.50.51.040.50.5(人溶血素)0.50.550.51.5實(shí)驗(yàn)步驟混勻，37，30min溶血素，即兔抗綿羊紅細(xì)胞抗體，是以SRBC作為抗原免疫家兔所得的兔血清，一般實(shí)驗(yàn)前56、30min滅活補(bǔ)體。以溶血素最高稀釋度能產(chǎn)生完全溶血者確定為一個(gè)單位，正式試驗(yàn)中一般使用兩個(gè)單位溶血素。5253結(jié)果成分管號(hào)1%S

18、RBC羊溶血素(2單位)補(bǔ) 體(2單位)生理鹽水結(jié)果10.50.50.50.5溶血20.50.51.0不溶30.50.51.0不溶40.50.5(人溶血素)0.50.5不溶50.51.5不溶觀看細(xì)胞免疫的示教片5455用Hanks液配成1106 細(xì)胞/ml的淋巴細(xì)胞懸液。提取外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）T細(xì)胞、B細(xì)胞表面具有抗原識(shí)別受體和有絲分裂原受體植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）選擇性刺激T細(xì)胞增殖；脂多糖（LPS）、葡萄球菌A蛋白（SPA）可刺激B細(xì)胞增殖；56美洲商陸58成熟的人T細(xì)胞表面表達(dá)綿羊紅細(xì)胞（SRBC）受體（即CD2分子），能與SRBC結(jié)合形成玫瑰花環(huán)樣結(jié)構(gòu)，可在光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。本法可用于檢測(cè)外周血T細(xì)胞的數(shù)量和比例，由此可間接反映機(jī)體的細(xì)胞免疫功能狀況