華北理工藥物分析教案第16章 抗生素類藥物的分析

1、 課程名稱：藥物分析 第 14周，第 25講次摘 要授課題目（章、節(jié)）第十六章 抗生素類藥物的分析 第一節(jié) 概述 第二節(jié)-內(nèi)酰胺類分析 第三節(jié)氨基糖苷類分析 第四節(jié) 四環(huán)素類分析 【目的要求】通過本講課程的學(xué)習(xí)，掌握抗生素類藥物的類型、結(jié)構(gòu)、質(zhì)量和穩(wěn)定性特點、以及分析方法。熟悉各類抗生素藥物的有關(guān)物質(zhì)來源、特點和檢查方法。了解：抗生素藥物的體內(nèi)樣品分析方法和臨床監(jiān)測應(yīng)用?！局?點】抗生素類藥物的鑒別原理與方法。含量測定的原理、測定方法?！倦y 點】抗生素類藥物的鑒別原理與方法。含量測定的原理、測定方法。內(nèi) 容【本講課程的引入】抗生素antibiotics是臨床常用的一類重要藥物。本章圍繞抗生素類

2、藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)和分析方法之間的關(guān)系，結(jié)合中國藥典，重點講解本類藥物的鑒別、檢查和含量測定的原理和方法。板書“抗生素類藥物的分析”?！颈局v課程的內(nèi)容】第一節(jié) 概述抗生素(Antibiotics)類藥物是臨床上常用的一類重要藥物，臨床使用的抗生素的主要是生物合成，經(jīng)過發(fā)酵和提純兩步制得；也有少數(shù)是利用化學(xué)合成或半合成方法制得。ChP2010共收載抗生素類原料藥及其各種制劑近300個品種。一、抗生素類藥物的定義和特點 青霉素于1929年被Flemmimg發(fā)現(xiàn)，至1943年鏈霉素的發(fā)現(xiàn)者賽爾曼瓦克斯曼才給出了抗生素的定義，即微生物代謝產(chǎn)生的能抑制它種微生物生長活動甚至殺滅它種微生物的化學(xué)物質(zhì)。

3、一般認(rèn)為，比較確切的抗生素的定義應(yīng)為：抗生素是生物(包括微生物、植物、動物)在其生命活動中產(chǎn)生的(或并用化學(xué)、生物或生化方法衍生的)，能在低微濃度下有選擇地抑制或影響它種生物機能的化學(xué)物質(zhì)的總稱。與化學(xué)合成藥物相比，其結(jié)構(gòu)、組成更復(fù)雜，表現(xiàn)為：1. 化學(xué)純度較低 有三多：即同系物多，如慶大霉素、新霉素、等含有多個組分；異構(gòu)體多，半合成b-內(nèi)酰胺抗生素、氨基糖苷類抗生素具有旋光性，均存在光學(xué)異構(gòu)體，如藥用巴龍霉素為兩個立體異構(gòu)體巴龍霉素I和巴龍霉素II的混合物；降解物多，如四環(huán)素類存在脫水、差向異構(gòu)體。2. 活性組分易發(fā)生變異 微生物菌株的變化、發(fā)酵條件改變等均可導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量發(fā)生變化，如組分的組

4、成或比例的改變。3. 穩(wěn)定性差 抗生素分子結(jié)構(gòu)中通常含有活潑基團，而這些基團往往是抗生素的活性中心，如青霉素、頭孢菌素類結(jié)構(gòu)中的b-內(nèi)酰胺環(huán)，鏈霉素結(jié)構(gòu)中的醛基等均具有穩(wěn)定性差的特點。 二、根據(jù)抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類 1-內(nèi)酰胺類：青霉素：青霉素鉀（鈉）、阿莫西林、氨芐西林等頭孢菌素類：頭孢他啶、頭孢拉啶等2氨基糖苷類：鏈霉素、慶大霉素、巴龍霉素、萘替米星等3四環(huán)素類：四環(huán)素、金霉素、土霉素等4大環(huán)內(nèi)脂類：紅霉素、麥迪霉素、螺旋霉素等5多烯大環(huán)類：制霉菌素、兩性霉素B等6多肽類：多黏菌素、放線菌素等7苯烴胺類：氯霉素等。8.蒽環(huán)類：阿霉素、紫紅霉素等9其他抗生素（凡不屬于上述類型的抗生素）均歸于

5、其他類。三、抗生素類藥物的細(xì)菌耐藥性 在長期的抗生素選擇之后出現(xiàn)的對相應(yīng)抗生素產(chǎn)生耐受能力的微生物，統(tǒng)稱耐藥菌。所謂細(xì)菌耐藥性(bacterial resistance)又稱抗藥性，是指細(xì)菌產(chǎn)生的對抗菌藥不敏感的現(xiàn)象，是細(xì)菌自身生存過程的一種特殊表現(xiàn)形式。 1. 耐藥性的種類 2. 耐藥的機制四、抗生素藥物的質(zhì)量分析 抗生素類藥物的質(zhì)量控制方法與一般化學(xué)藥品一樣，通過鑒別、檢查、含量(效價)測定三個主要方面來判斷其質(zhì)量的優(yōu)劣。由于抗生素類藥物的特點，其分析方法可分為理化方法和生物學(xué)法兩大類。 (一) 鑒別試驗 抗生素類藥物的鑒別試驗主要為理化方法，常用方法有： 1. 官能團的顯色反應(yīng) 如b-內(nèi)

6、酰胺環(huán)的羥肟酸鐵反應(yīng)；鏈霉素的麥芽酚反應(yīng)、坂口反應(yīng)。對于抗生素鹽類，通常鑒別酸根或金屬離子或有機堿。 2. 光譜法 包括紅外光譜與紫外吸收光譜的鑒別?？股氐募t外光譜分析時需注意，由于抗生素存在多晶現(xiàn)象，有時對照品與供試品圖譜或?qū)φ請D譜不一致，最好用相同溶劑同時重結(jié)晶供試品和對照品，使處于相同晶型情況下再進行測定，若多晶效應(yīng)是由于研磨和壓片過程中的晶相轉(zhuǎn)變所致，則應(yīng)采用溶液法試驗。3. 色譜法 包括TLC和HPLC法，采用對照品或標(biāo)準(zhǔn)品對照法。 4. 生物學(xué)法 是檢查抗生素滅活前后的抑菌能力，并與已知含量的對照品對照后進行鑒別，此法已很少應(yīng)用。 (二) 檢查抗生素類藥物的檢查項目包括：1. 影

7、響產(chǎn)品穩(wěn)定性的檢查項目 結(jié)晶性、酸堿度、水分或干燥失重等；2. 控制有機和無機雜質(zhì)的檢查項目 溶液的澄清度與顏色、有關(guān)物質(zhì)、殘留溶劑、熾灼殘渣、重金屬等；3. 與臨床安全性密切相關(guān)的檢查項目 異常毒性、熱源或細(xì)菌內(nèi)毒素、降壓物質(zhì)、無菌等；4. 其他檢查項目 對于多組分抗生素還要進行組分分析等(如硫酸慶大霉素的“慶大霉素C組分的測定”)。此外，有些抗生素還規(guī)定 “懸浮時間與抽針試驗”(如注射用普魯卡因青霉素)、 “聚合物”(如b-內(nèi)酰胺類抗生素)、“雜質(zhì)吸光度”(如四環(huán)素類抗生素)等。 (三) 含量或效價測定 1. 微生物檢定法 本法系在適宜條件下，根據(jù)量反應(yīng)平行線原理設(shè)計，通過檢測抗生素對微生

8、物的抑制作用，計算抗生素活性(效價)的方法。測定方法可分為管碟法和濁度法 2. 理化方法 是根據(jù)抗生素的分子結(jié)構(gòu)特點，利用其特有的化學(xué)或物理化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)而進行的。對于提純的產(chǎn)品以及化學(xué)結(jié)構(gòu)已確定的抗生素，能較迅速、準(zhǔn)確地測定其效價，并具有較高的專屬性。第二節(jié) -內(nèi)酰胺類一、結(jié)構(gòu)特點與分析方法之間的關(guān)系1.-內(nèi)酰胺環(huán)：易降解，可利用降解產(chǎn)物進行鑒別和含量測定。芳環(huán)側(cè)鏈：具有紫外吸收，可進行鑒別和含量測定。本類抗生素包括青霉素類和頭孢菌素類，它們的分子結(jié)構(gòu)中均含有-內(nèi)酰胺環(huán)，因此統(tǒng)稱為-內(nèi)酰胺類抗生素。2性質(zhì)(1) -內(nèi)酰胺環(huán)的不穩(wěn)定性：-內(nèi)酰胺環(huán)是該類抗生素的結(jié)構(gòu)活性中心，其性質(zhì)活潑，是分子結(jié)

9、構(gòu)中最不穩(wěn)定部分，其穩(wěn)定性與含水量和純度有很大關(guān)系。干燥條件下青霉素和頭孢菌素類藥物均較穩(wěn)定，室溫條件下密封保存可貯存3年以上，但他們的水溶液很不穩(wěn)定，隨pH和溫度而有很大變化。青霉素水溶液在pH66.8時較穩(wěn)定。本類藥物在酸、堿、青霉素酶、羥胺及某些金屬離子(銅、鉛、汞和銀)或氧化劑等作用下，易發(fā)生水解和分子重排，導(dǎo)致-內(nèi)酰胺環(huán)的破壞而失去抗菌活性。(2) 旋光性： 青霉素類分子中含有三個手性碳原子，頭孢菌素類含有兩個手性碳原子，故都具有旋光性。根據(jù)此性質(zhì)，可用于定性和定量分析。 (3) 酸性與溶解度： 青霉素類和頭孢菌素類分子中的游離羧基具有相當(dāng)強的酸性，大多數(shù)青霉素類化合物的pKa在2.

10、52.8之間，能與無機堿或某些有機堿形成鹽。其堿金屬鹽易溶于水，而有機堿鹽難溶于水，易溶于甲醇等有機溶劑。青霉素的堿金屬鹽水溶液遇酸則析出游離基的白色沉淀。 (4) 紫外吸收特性： 青霉素類分子中的母核部分無共軛系統(tǒng)，但其側(cè)鏈酰胺基上R取代基若有苯環(huán)等共軛系統(tǒng)，則有紫外吸收特征。如青霉素鉀(鈉)的R為芐基，因而其水溶液在264nm波長處具有較強的紫外吸收。而頭孢菌素類母核部分具有OCNCC結(jié)構(gòu)，R取代基具有苯環(huán)等共軛系統(tǒng)，有紫外吸收。 二、鑒別試驗本類藥物的鑒別試驗，現(xiàn)版ChP，USP，BP采用的方法主要為HPLC、IR和TLC法。 (一) 色譜法 利用比較供試品溶液主峰與對照品溶液主峰的保留

11、時間(tR)是否一致或比較供試品溶液與對照品溶液所顯主斑點的位置和顏色是否相同進行鑒別。HPLC法一般都規(guī)定在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰應(yīng)與對照品溶液主峰的保留時間一致。中國藥典對鑒別試驗中有HPLC法又有TLC法的，規(guī)定可在兩種鑒別方法中選做一種。 (二) 光譜法 1. 紅外吸收光譜(IR) 紅外吸收光譜反映了分子的結(jié)構(gòu)特征，各國藥典對收載的-內(nèi)酰胺類抗生素幾乎均采用了本法進行鑒別。該類抗生素的-內(nèi)酰胺環(huán)羰基的伸縮振動(1750cm-11800cm-1)，仲酰胺的氨基、羰基的伸縮振動(3300cm-1，1525 cm-1，1680 cm-1)、羧酸離子的伸縮振動(1600cm

12、-1，1410cm-1)是該類抗生素共有的特征峰。2. 紫外吸收光譜(UV) 本類藥物的紫外光譜鑒別法通常利用最大吸收波長鑒定法：將供試品配成適當(dāng)濃度的溶液，直接測定紫外吸收光譜，根據(jù)其最大吸收波長或最大吸收波長處的吸光度進行鑒定。如頭孢唑啉鈉的紫外鑒別法：取本品適量，加水溶解并稀釋制成每1ml中約含16mg的溶液，在272nm的波長處有最大吸收。 (三) 呈色反應(yīng) 1.羥肟酸鐵反應(yīng) 青霉素與頭孢菌素在堿性中與羥胺作用，-內(nèi)酰胺環(huán)破裂生成羥肟酸；在稀酸中與高鐵離子呈色。 2. 類似肽鍵的反應(yīng) 本類藥物具有-CONH-結(jié)構(gòu)，一些取代基有a-氨基酸結(jié)構(gòu)，可顯雙縮脲和茚三酮反應(yīng)。 3. 其他呈色反應(yīng)

13、 側(cè)鏈含有-C6H5-OH基團時，能與重氮苯磺酸試液產(chǎn)生偶合反應(yīng)而呈色。此外，本類藥物還可與變色酸-硫酸、硫酸-甲醛等試劑反應(yīng)而呈色。 (四) 各種鹽的反應(yīng) 鉀、鈉離子的火焰反應(yīng) 三、檢查 本類抗生素的雜質(zhì)主要有高分子聚合物，有關(guān)物質(zhì)，異構(gòu)體等，一般采用HPLC法控制其限量，也有采用測定雜質(zhì)的吸光度來控制雜質(zhì)量的。此外，有的還進行結(jié)晶性、抽針與懸浮時間等有效性試驗，部分抗生素還檢查有機溶劑殘留量。 (一) 聚合物 (二) 有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體 (三) 吸光度 (四) 有機溶劑 (五) 結(jié)晶性四、含量測定各國藥典收載的青霉素類和頭孢菌素類的含量測定除少數(shù)幾個樣品采用抗生素微生物檢定法測定外，大多采用

14、HPLC測定方法。 高效液相色譜法是近年來發(fā)展最快的方法，它能有效地分離供試品中可能存在的降解產(chǎn)物、未除盡的原料及中間體等雜質(zhì)，并能準(zhǔn)確定量，適用于本類藥物的原料、各種制劑及生物樣本的分析測定。ChP2010收載的本類抗生素中除磺芐西林鈉采用微生物檢定法測定含量外，其余均采用HPLC法測定含量。 第三節(jié) 氨基糖苷類氨基糖苷類抗生素抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)都是以堿性環(huán)己多元醇為苷元，與氨基糖縮合而成的苷，故稱為氨基糖苷類抗生素(Aminoglycosides Antibiotics)。主要有硫酸鏈霉素、硫酸慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、鹽酸大觀霉素、硫酸小諾霉素、硫酸巴龍霉素、硫酸卡那霉素、硫酸西索霉素

15、、硫酸阿米卡星、硫酸依替米星、硫酸核糖霉素、硫酸新霉素等，它們的抗菌譜和化學(xué)性質(zhì)都有共同之處。 鏈霉素：由鏈霉胍、鏈霉糖、N-甲基-L-葡萄糖胺結(jié)合而成。慶大霉素：絳紅糖胺、2-脫氧鏈霉胺和加洛糖胺縮合而成。性質(zhì) 氨基糖苷類抗生素的分子結(jié)構(gòu)具有一些共同或相似處。1.慶大霉素、巴龍霉素、奈替米星等分子中氨基環(huán)醇(脫氧鏈霉胺)結(jié)構(gòu)與鏈霉素中鏈霉胍相近； 2.D-核糖與鏈霉糖相似；胺基己糖(D-葡萄糖胺)結(jié)構(gòu)與鏈霉素中N-甲基葡萄糖胺相似，因此，他們具有相似的性質(zhì)。溶解度與堿性 該類抗生素的分子中含有多個羥基(故也稱多羥基抗生素)和堿性基團(分子式中有*號處)，同屬堿性、水溶性抗生素，能與礦酸或有機

16、酸成鹽，臨床上應(yīng)用的主要為硫酸鹽。他們的硫酸鹽易溶于水，不溶于乙醇、三氯甲烷、乙醚等有機溶劑。2. 旋光性 本類抗生素分子結(jié)構(gòu)中含有多個氨基糖，具有旋光性。如ChP2010二部中硫酸奈替米星的比旋度為+88+96(水溶液)；硫酸慶大霉素的比旋度為+107+121(水溶液)；硫酸巴龍霉素的比旋度為+50+55(水溶液)。 3. 苷的水解與穩(wěn)定性 含有二糖胺結(jié)構(gòu)的抗生素(如鏈霉素、巴龍霉素、新霉素)，分子中氨基葡萄糖與鏈霉糖或D-核糖之間的苷鍵較強，而鏈霉胍與鏈霉雙糖胺(苷元與二糖胺)間的苷鍵結(jié)合較弱。一般的化學(xué)反應(yīng)只能將他們分解為一分子苷元和一分子雙糖。鏈霉素的硫酸鹽水溶液，一般以pH57.5最

17、為穩(wěn)定，過酸或過堿條件下易水解失效。在酸性條件下，鏈霉素水解為鏈霉胍和鏈霉雙糖胺，進一步水解則得N-甲基-L-葡萄糖胺；堿性也能使鏈霉素水解為鏈霉胍及鏈霉雙糖胺，并使鏈霉糖部分發(fā)生分子重排，生成麥芽酚(maltol)，這一性質(zhì)為鏈霉素所特有，可用于鑒別和定量。硫酸慶大霉素、硫酸奈替米星等對光、熱、空氣均較穩(wěn)定，水溶液亦穩(wěn)定，pH212時，100加熱30分鐘活性無明顯變化。4. 紫外吸收光譜 鏈霉素在230nm處有紫外吸收。慶大霉素、奈替米星等無紫外吸收。 二、鑒別試驗(一) 茚三酮反應(yīng) 本類抗生素為氨基糖苷結(jié)構(gòu)，具有羥基胺類和a-氨基酸的性質(zhì)，可與茚三酮縮合成藍(lán)紫色化合物。中國藥典采用本法鑒別

18、硫酸小諾霉素及其制劑。 硫酸小諾霉素的茚三酮反應(yīng)鑒別法：取本品約5mg，加水1ml溶解后，加0.1%茚三酮的水飽和正丁醇溶液1ml與吡啶0.5ml，在水浴中加熱5分鐘，即呈紫藍(lán)色。 (二) Molisch試驗 具有五碳糖或六碳糖結(jié)構(gòu)的氨基糖苷類抗生素經(jīng)酸水解后，在鹽酸(或硫酸)作用下脫水生成糠醛(五碳糖)或羥甲基糠醛(六碳糖)。這些產(chǎn)物遇a-萘酚或蒽酮呈色。 阿米卡星的蒽酮呈色鑒別：取本品約10mg，加水1ml 溶解后，加0.1%蒽酮的硫酸溶液4ml，即顯藍(lán)紫色。 (三) N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)(Elson-Morgan反應(yīng)) 本類藥物經(jīng)水解，產(chǎn)生葡萄糖胺衍生物，如鏈霉素中的N-甲基葡萄糖胺，硫

19、酸新霉素、硫酸巴龍霉素中的D-葡萄糖胺，在堿性溶液中與乙酰丙酮縮合成吡咯衍生物(I)，與對二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液(Ehrlich試劑)反應(yīng)，生成櫻桃紅色縮合物(II)。 (四) 麥芽酚(Maltol)反應(yīng) 此為鏈霉素的特征反應(yīng)。鏈霉素在堿性溶液中，鏈霉糖經(jīng)分子重排使環(huán)擴大形成六元環(huán)，然后消除N-甲基葡萄糖胺，再消除鏈霉胍生成麥芽酚(a-甲基-b-羥基-g-吡喃酮)，麥芽酚與高鐵離子在微酸性溶液中形成紫紅色配位化合物。 (五) 坂口(Sakaguchi)反應(yīng) 此為鏈霉素水解產(chǎn)物鏈霉胍的特有反應(yīng)。本品水溶液加氫氧化鈉試液，水解生成鏈霉胍。鏈霉胍和8-羥基喹啉(或a-萘酚)分別同次溴酸鈉反應(yīng)，其

20、各自產(chǎn)物再相互作用生成橙紅色化合物。 (六) 硫酸鹽反應(yīng) 本類藥物多為硫酸鹽，因此，各國藥典都將硫酸根的鑒定作為鑒別這類抗生素的一個方法。 (七) 色譜法 1. 薄層色譜法 ChP2010、USP34-NF29和BP2010均采用TLC法對本類抗生素進行鑒別。多以硅膠為薄層板，三氯甲烷-甲醇-濃氨水為展開劑，茚三酮或碘蒸氣為顯色劑。 2. 高效液相色譜法 本類藥物也可根據(jù)組分檢查或含量測定項下HPLC方法，通過比較供試品溶液和對照品溶液的色譜圖進行鑒別。(八) 光譜法 1. 紅外吸收光譜 中國藥典和英國藥典均采用紅外光譜法鑒別本類藥物，如硫酸慶大霉素、硫酸巴龍霉素、硫酸卡那霉素、硫酸阿米卡星、

21、硫酸新霉素、硫酸鏈霉素等。 2. 紫外吸收光譜 本類藥物多無紫外吸收，故其鑒別試驗中很少采用紫外法。但BP2010利用這一性質(zhì)，采用紫外法對慶大霉素進行鑒別， 三、有關(guān)物質(zhì)及組分分析(一) 有關(guān)物質(zhì)檢查 現(xiàn)版各國藥典對本類抗生素的有關(guān)物質(zhì)檢查主要采用TLC和HPLC法。(二) 組分測定 本類抗生素多為同系物組成的混合物，同系物的效價、毒性各不相同，為保證藥品的質(zhì)量，必須控制各組分的相對含量，如ChP對硫酸慶大霉素、硫酸小諾霉素等規(guī)定了組分分析。 (三) 硫酸鹽檢查 本類抗生素臨床應(yīng)用的主要為硫酸鹽，各國藥典規(guī)定EDTA絡(luò)合滴定法或HPLC法測定硫酸鹽含量，作為組分分析。 四、含量測定氨基糖苷類

22、抗生素的效價測定主要有微生物檢定法和HPLC法。氨基糖苷類抗生素的HPLC測定法可分為離子交換(酸性條件下在陽離子交換柱上分離)、離子對(以烷基磺酸鹽為反離子)和反相HPLC法，由于本類抗生素多數(shù)無紫外吸收， 不能直接用紫外或熒光檢測器，需進行柱前或柱后衍生化，或采用電化學(xué)檢測器、蒸發(fā)光檢測器檢測。ChP2010采用HPLC-蒸發(fā)光散射法測定硫酸卡那霉素、硫酸依替米星等藥物的含量。慶大霉素C組分的測定1）測定的意義：慶大霉素C1、C2、C1a對微生物的活性無明顯差別，但其毒副作用和耐藥性有差異，導(dǎo)致各組分的相對百分含量。2）測定步驟衍生化反應(yīng)：因為慶大霉素?zé)o紫外吸收，故需進行衍生化處理后再進行

23、高效液相色譜法測定。其方法是利用慶大霉素C組分結(jié)構(gòu)中氨基同鄰苯二醛（o-phthalbehyde，OPA）、巰基醋酸在pH10.4的硼酸鹽緩沖液中反應(yīng)，生成1-烷基硫代-2-烷基異吲哚衍生物，在330nm波長處有強吸收。測定樣品：分別進樣經(jīng)衍生化后的樣品與標(biāo)準(zhǔn)品，量取C1、C2、C1a、C2a的峰面積，以外標(biāo)-峰面積歸一化法計算各組分的相對含量。第四節(jié) 四環(huán)素類 四環(huán)素類抗生素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上，都具有四個并苯或萘并萘環(huán)構(gòu)成，故統(tǒng)稱為四環(huán)素類(tetracyclines)抗生素。一、化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 1共軛雙鍵：具有紫外吸收，并可產(chǎn)生熒光，可進行鑒別和含量測定。2具有酚羥基、烯醇基：可發(fā)生三氯化鐵反應(yīng)

24、、可與金屬離子絡(luò)合，用于鑒別。3.手性碳原子：具旋光性，用于鑒別。性質(zhì) 1. 酸堿性與溶解度 本類抗生素的母核上C4位上的二甲氨基-N(CH3)2 顯弱堿性； C10位上的酚羥基(-OH)和兩個含有酮基和烯醇基的共軛雙鍵系統(tǒng)(式中虛線內(nèi)所示部分)顯弱酸性，故四環(huán)素類抗生素是兩性化合物。遇酸及堿，均能生成相應(yīng)的鹽，臨床上多應(yīng)用鹽酸鹽。這類抗生素是結(jié)晶性物質(zhì)，具引濕性。其鹽酸鹽易溶于水，并溶于堿或酸性溶液中，而不溶于三氯甲烷、乙醚等有機溶劑。四環(huán)素類抗生素的游離堿在水中的溶解度很小，其溶解度與溶液的pH值有關(guān)，在pH4.57.2之間時難溶于水；當(dāng)pH值高于8或低于4時，水中溶解度增加。其鹽類在水中

25、會水解，當(dāng)溶液濃度較大時，會析出游離堿。2. 旋光性 四環(huán)素類抗生素分子中具有不對稱碳原子，因此有旋光性，可用于定性、定量分析。各國藥典測定該類抗生素的比旋度，如中國藥典規(guī)定鹽酸土霉素在鹽酸(91000)溶液中的比旋度為-188-200；鹽酸四環(huán)素的比旋度為-240-258(0.01mol/L鹽酸溶液)。鹽酸多西環(huán)素的比旋度為-105-120 鹽酸溶液(91000)的甲醇溶液(1100) 。3. 紫外吸收和熒光性質(zhì) 本類抗生素分子內(nèi)含有共軛雙鍵系統(tǒng)，在紫外光區(qū)有吸收，如中國藥典中鹽酸多西環(huán)素的甲醇溶液在269nm和353nm的波長處有最大吸收，在234nm和296nm的波長處有最小吸收。鹽酸美

26、他環(huán)素的水溶液在345nm、282nm和353nm的波長處有最大吸收，在264nm和222nm的波長處有最小吸收。 4. 穩(wěn)定性 四環(huán)素類抗生素對各種氧化劑(包括空氣中氧在內(nèi))、酸、堿都是不穩(wěn)定的。干燥的四環(huán)素類游離堿和他們的鹽類避光條件下保存均較穩(wěn)定，但其水溶液隨pH的不同會發(fā)生差向異構(gòu)化、降解等反應(yīng)，尤其是堿性水溶液特別容易氧化，顏色很快變深，形成色素。 (1) 差向異構(gòu)化性質(zhì)：四環(huán)素類抗生素在弱酸性(pH2.06.0)溶液中會發(fā)生差向異構(gòu)化。這個反應(yīng)是由于A環(huán)上手性碳原子C4構(gòu)型的改變，發(fā)生差向異構(gòu)化，形成差向四環(huán)素類。反應(yīng)是可逆的，達(dá)到平衡時溶液中差向化合物的含量可達(dá)40%60%。 (

27、2) 降解性質(zhì)： 酸性降解 在酸性條件下(pH2)，特別是在加熱情況下，四環(huán)素類抗生素C6上的醇羥基和C5a上的氫發(fā)生反式消去反應(yīng)生成脫水四環(huán)素(anhydrotetracycline，ATC)。堿性降解 在堿性溶液中，由于氫氧離子的作用，C6上的羥基形成氧負(fù)離子，向C11發(fā)生分子內(nèi)親核進攻，經(jīng)電子轉(zhuǎn)移，C環(huán)破裂，生成無活性的具有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的異構(gòu)體。二、鑒別方法1. 高效液相色譜法 ChP和USP等，均采用高效液相色譜法鑒別鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸多西環(huán)素、鹽酸金霉素等。在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時間應(yīng)與對照品溶液主峰的保留時間一致。 2. 薄層色譜法 由于薄層色譜法

28、設(shè)備簡單，操作容易，分離效果亦佳，ChP2010、BP2010都采用本法鑒別四環(huán)素類抗生素。四環(huán)素類抗生素的薄層色譜法多采用硅藻土作載體，為了獲得較好的分離，在粘合劑中加有甘油以及中性的EDTA緩沖液。EDTA可以克服因痕量金屬離子存在而引起的斑點拖尾現(xiàn)象。 3. IR光譜法 中國藥典收載的四環(huán)素類抗生素中，除土霉素外均采用了紅外光譜法鑒別。 4. UV光譜法 本類藥物的紫外鑒別法多以甲醇或水溶液為溶劑，中國藥典規(guī)定最大吸收波長和最小吸收波長。ChP2010鹽酸美他環(huán)素和鹽酸多西環(huán)素的UV鑒別：鹽酸美他環(huán)素10mg/ml的水溶液在345nm、282nm和353nm的波長處有最大吸收，在264n

29、m和222nm的波長處有最小吸收。5. 顯色法 四環(huán)素類抗生素遇硫酸立即產(chǎn)生顏色，不同的四環(huán)素類抗生素具有不同的顏色，有的有顏色變化，據(jù)此可區(qū)別各種四環(huán)素類抗生素。本類抗生素分子結(jié)構(gòu)中具有酚羥基，遇三氯化鐵試液即呈色。 四、雜質(zhì)檢查(一) 有關(guān)物質(zhì) 四環(huán)素類抗生素中的有關(guān)物質(zhì)主要是指在生產(chǎn)和貯存過程中易形成的異構(gòu)雜質(zhì)、降解雜質(zhì)(ETC、ATC、EATC)等。ChP2010、USP34-NF29和BP2010均采用HPLC法控制四環(huán)素類抗生素中的有關(guān)物質(zhì)。測定方法：取供試品分別配成2.0mg/ml和0.04mg/ml的溶液，作為供試液和對照液，分別進樣，記錄色譜圖至主峰保留時間的4倍，供試液如顯雜質(zhì)峰，與對照液主峰面積比較，含ETC、鹽酸金霉素、ATC、EATC分別不得超過4.0%、1.0%、0.5%、0.5%。 (二) 雜質(zhì)吸光度 四環(huán)類抗生素多為黃色結(jié)晶性粉末；而異構(gòu)體、降解產(chǎn)物顏色較深，如差向四環(huán)素為淡黃色，因其不穩(wěn)定又易變成黑色；脫水四環(huán)素為橙紅色；差向脫水四環(huán)素為磚紅色。此類雜質(zhì)的存在均可使四環(huán)素類抗生素的外觀色澤變深。因此和BP20