多克隆抗體的制備,純化及檢測

1、實(shí)驗(yàn)九多克隆抗體的制備，純化及免疫電泳【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹考由顚?duì)抗體基本知識(shí)的了解。了解多克隆抗體的制備及純化的基本方法。了解免疫電泳的基本過程和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。一、多克隆抗體的制備【實(shí)驗(yàn)原理】當(dāng)將抗原注射入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，一系列抗體生成細(xì)胞會(huì)不同程度的與抗原結(jié)合，受抗原刺激后在血液中產(chǎn)生不同類型的抗體，這種由一種抗原刺激產(chǎn)生的抗體稱為多克隆抗體。多克隆抗體中不同的抗體分子可以以不同的親和能力與抗原分子表面不同的部分一抗原決定簇相結(jié)合。將抗原導(dǎo)入敏感動(dòng)物體內(nèi)后，可刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)，尤其是淋巴結(jié)和脾臟中的淋巴細(xì)胞大量增殖。如圖所示，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)初次免疫和二次免疫的應(yīng)答有明顯的不同。通常初次免疫應(yīng)答往往比較弱

2、，尤其是針對(duì)于易代謝，可溶性的抗原。首次注射后大約7天，在血清中可以觀察到抗體但抗體的濃度維持在一個(gè)較低的水平，在大約10天左右抗體的滴度會(huì)達(dá)到最大值。但同種抗原注射而產(chǎn)生的二次免疫應(yīng)答的結(jié)果明顯不同，和初次免疫應(yīng)答相比抗體的合成速度明顯增加并且保留時(shí)間也長。免疫應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)結(jié)果取決于抗原和免疫動(dòng)物的種類，但初次和二次免疫應(yīng)答之間的關(guān)系是免疫應(yīng)答的一個(gè)重要特點(diǎn)。三次或以后的抗原注射所產(chǎn)生的應(yīng)答和二次應(yīng)答結(jié)果相似:抗體的滴度明顯增加并且血清中抗體的種類和性質(zhì)發(fā)生了改變，這種改變被稱為免疫應(yīng)答的成熟，具有重要的實(shí)際意義。通常在抗原注射4-6周后會(huì)產(chǎn)生具有高親和力的抗體?！緦?shí)驗(yàn)材料】1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年兔

3、。實(shí)驗(yàn)器材特制兔盒；刀片；25G針頭；1ml注射器；20ml血液收集管；藥鏟；離心機(jī)以及塑料離心管；加樣器及加樣管；燒杯。實(shí)驗(yàn)試劑抗原；乙醇；20mM磷酸緩沖溶液pH7.2。福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑：福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑的成分成分完全佐劑不完全佐劑石蠟油6份+無水羊毛脂4份+殺死的分枝桿菌3-5mg+-磷酸緩沖溶液10份+福氏完全佐劑的制備：使用前在福氏不完全佐劑中加入適量殺死的分枝桿菌）【實(shí)驗(yàn)方法】抗原的制備抗原制備的主要目的在于在免疫動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生最強(qiáng)、最適當(dāng)?shù)目贵w。由于純化的抗原適合產(chǎn)生抗體，因此在注射前通常采用一些經(jīng)典的方法，比如柱層析、分級(jí)萃取、亞細(xì)胞分離等進(jìn)行抗原的分離和

4、純化。如果多肽抗原在SDS/PAGE中為可見的單一帶，抗原從凝膠中的抽提可作為純化的最后一個(gè)步驟。預(yù)放血輕輕的將兔子放在特制兔盒中，處于放松狀態(tài)的兔子采血會(huì)較容易。按壓兔子耳根部直至血管突出,然后將針頭插入耳部血管的中上部，觀察到進(jìn)針后小心推出活塞收集血液1ml-5ml。結(jié)束收集后，退出針頭并按壓傷處以制止血流，再用乙醇消毒。取收集的血液在37C恒溫箱中放置30分鐘以防止激活補(bǔ)體系統(tǒng)，再將試管在4C放置過夜使血液凝固。用藥鏟將血凝塊從管壁上撥落，將血液轉(zhuǎn)移至塑料離心管中，4C,10,000g離心10分鐘，收集上清液在4C保存。注射抗原準(zhǔn)備兩只成年兔，將100卩g抗原/兔溶入1ml磷酸緩沖溶液中

5、待用。在1ml福氏不完全佐劑中加入分枝桿菌制成完全佐劑，并加入1ml抗原溶液，劇烈震蕩使之充分乳化，用3ml注射器抽取該乳化液，接上25G針頭，排除注射器中的氣泡。從籠中取出兔子放在平坦處，在4個(gè)不同的部位進(jìn)行皮下注射，兩處在后背，兩處在大腿處。撫去注射處的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮膚。捏出皮膚，將針頭以相對(duì)皮膚15度的角度進(jìn)針，進(jìn)針深度為1cm-2cm,小心不要刺入肌肉中，在4個(gè)不同部位分別各注射約500卩l(xiāng)抗原溶液。注射結(jié)束后，將針在注射處放置幾秒鐘后再輕輕拔出，并用乙醇在注射處消毒。在4個(gè)部位重復(fù)上述操作。用相同方法免疫另一只家兔。每4-6周注射抗原，并在注射后的7天-10天按照步驟2收集

6、血液。將收集的血液與注射前收集的血液進(jìn)行比較，檢查是否有抗體產(chǎn)生。待確定產(chǎn)生抗體后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。4收集血液將家兔輕輕放入固定架上,二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片傾斜45在該處切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在結(jié)束之前出現(xiàn)凝固可用溫水輕擦切口處，再繼續(xù)收集。收集適量血液后可用消毒后的紗布輕擦患處，輕按患處10秒-20秒確定血流停止后方可結(jié)束。將血液在37C恒溫箱中放置30分鐘，再在4C放置過夜。用藥鏟將血凝塊從管壁上撥落，將血液轉(zhuǎn)移至塑料離心管中，4C,10,000g離心10分鐘，收集上清液即

7、為抗血清,可在-20C保存數(shù)年?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】利用蛋白質(zhì)免疫印跡法或免疫電泳方法檢查抗體產(chǎn)生情況。二、親和層析法純化抗體【實(shí)驗(yàn)原理】如圖所示，親和層析的高度選擇性使得從某一初始材料中純化，富集某一含量較低的目的蛋白成為可能，因此親和層析是蛋白質(zhì)分離純化過程中最有效的方法之一。另外，如果配基與蛋白質(zhì)的親和能力很強(qiáng)，也可同時(shí)進(jìn)行樣品的濃縮。雖然多數(shù)情況下不需要將抗體與其他血清蛋白分開，但如果一旦需要，蛋白A親和層析是一種非常有效的分離方法。蛋白A是從Staphylococcusaureus中獲得，可與抗體重鏈的Fc片段相結(jié)合?，F(xiàn)在已知蛋白A可與多種哺乳動(dòng)物的IgG相結(jié)合也可與某些IgM和IgA相結(jié)合

8、。如果將蛋白A與固相載體相連，例如sepharoseCL-4B，這種填料可以成為分離和純化不同類型，不同亞類抗體或抗體片斷的重要工具?！緦?shí)驗(yàn)材料】1.實(shí)驗(yàn)儀器蛋白A柱(含10ml或5ml填料)；泵；離心管；離心機(jī)；pH試紙；過濾器；玻璃柱。2.實(shí)驗(yàn)試劑TBS緩沖溶液：6.06gTris(50mM),8.78gNaCl(150mM)以及0.5g疊氮化鈉(0.05%)溶于1L蒸餾水中，并用HCl調(diào)節(jié)pH7.4。(2)中和緩沖溶液：121.2gTris(1M),87.8gNaCl(1.5M),0.37gEDTA(1mM)及5g疊氮化鈉(0.5%)溶于1L蒸餾水中，并用HCl調(diào)節(jié)pH8.0。洗脫緩沖溶

9、液(pH2.7)：將3.75g甘氨酸(50mM)溶解于1L蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)pH2.7。洗脫緩沖溶液(pH1.9)：將3.75g甘氨酸(50mM)溶解于1L蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)pH1.9。配基與載體相連特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白親和層析的基本過程【實(shí)驗(yàn)方法】準(zhǔn)備蛋白AsepharoseCL-4B親和柱通常準(zhǔn)備5ml或10ml蛋白AsepharoseCL-4B填料，在真空瓶中將等體積的填料和TBS緩沖溶液混合，攪拌。抽真空約15分鐘以除去填料中的氣泡，否側(cè)在柱中形成的氣泡影響柱子的容量和分離效果。將蛋白AsepharoseCL-4B填料緩慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度為1ml/分-2ml/分，

10、避免柱干，利用10倍于床體積并經(jīng)過預(yù)冷的TBS緩沖溶液平衡柱子。制備抗血清將抗血清放入冰水或4C冰箱中緩慢解凍以避免蛋白質(zhì)的聚集。在蛋白質(zhì)解凍過程中出現(xiàn)的聚集可通過37C預(yù)熱而溶解。加入固體疊氮化鈉至濃度為0.05%，4C，15,000 xg離心5分鐘，移出澄清的抗血清再經(jīng)過濾器過濾除去多余的脂。親和層析將抗體用TBS緩沖溶液以1：5的比例進(jìn)行稀釋，再用過濾器進(jìn)行過濾。以每分鐘0.5ml的速度將抗血清上到柱上,為保證抗血清與填料的結(jié)合，需連續(xù)上柱2次并保留上樣流出液。用TBS緩沖溶液清洗柱子至AX28Onm0.008后加PH2.7洗脫緩沖溶液，以0.5ml/min的速度洗脫至所有蛋白均流下來。

11、用已經(jīng)加入100ul中和緩沖溶液的1.5mlEP管分管收集洗脫液,混勻后用pH試紙檢查洗脫液的pH，如果pH低于7可利用中和緩沖液調(diào)至約pH7.4以防止抗體的變性。在柱中加入10ml,pH1.9洗脫緩沖溶液，按上述方法收集洗脫液至人血80皿0.008。利用分光光度計(jì)測定各管中蛋白質(zhì)的含量。若蛋白濃度低于0.5mg/ml可加入10%的甘油以便保存，將純化的抗體分裝后在2C8C保存。用含0.05%疊氮化鈉的TBS緩沖溶液清洗柱子后將柱子儲(chǔ)存在2C8C環(huán)境?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】利用SDS/PAGE檢查洗脫獲得的蛋白純度并利用免疫電泳技術(shù)檢查純化后抗體的滴度?！咀⒁馐马?xiàng)】疊氮化鈉有毒，應(yīng)戴手套并小心操作在純化

12、過程中，預(yù)冷的TBS緩沖溶液可減少蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合和微生物的代謝。三、免疫電泳【實(shí)驗(yàn)原理】免疫電泳又稱為Y球蛋白電泳或免疫球蛋白電泳技術(shù)，這是一種能夠判斷血液中三種免疫球蛋白IgM,IgG,IgA含量水平的實(shí)驗(yàn)方法。在這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中，首先利用蛋白質(zhì)的分子量和所帶電荷的比值運(yùn)用水平瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，然后將特異性的抗體引入到與電泳方向平行的凹槽中，在抗原和抗體的擴(kuò)散過程中，抗原和抗體適當(dāng)比例的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致沉淀的產(chǎn)生(如圖)。0.85%鹽不僅可以終止擴(kuò)散過程也可用于洗去未結(jié)合的蛋白，抗原和抗體結(jié)合所形成的沉淀線即可以肉眼觀察也可利用染色方法觀察。免疫電泳技術(shù)不僅可用于血清或尿樣中

13、單克隆抗體的鑒定，也可用于其它方面，比如免疫復(fù)合物的篩選、別和鑒定等各種異常丙種球蛋白血癥的識(shí)。免疫電泳技術(shù)也是進(jìn)行蛋白質(zhì)常規(guī)評(píng)價(jià)的一種可靠，精確的實(shí)驗(yàn)方法，可觀察蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化和濃度的改變?！緦?shí)驗(yàn)材料】1實(shí)驗(yàn)器材水平電泳儀；打孔器；滴管；刀片；電源；水浴(55C)；蒸餾水；燒杯(400-600ml)；加樣槍(5-100ul)。2.實(shí)驗(yàn)試劑純化的抗體；蛋白質(zhì)混合物；1%瓊脂。(2)Tris-巴比妥緩沖溶液：2.24g巴比妥酸，4.43gTris，0.053g乳酸鈣及0.065g疊氮化鈉溶于100ml蒸餾水中。電泳緩沖溶液：將Tris-巴比妥緩沖溶液與蒸餾水按1：4的比例混合?！緦?shí)驗(yàn)方法】1準(zhǔn)

14、備瓊脂糖凝膠將瓊脂和電泳緩沖溶液混合放入90C水浴加熱至溶化，制成1%瓊脂，將瓊脂在冷卻前鋪在水平玻璃板上，待冷卻至室溫后，按圖用內(nèi)徑4毫米的打孔器打孔及制作凹槽。O40mm1+O2.電泳將用電泳緩沖溶液稀釋的4%-5%的抗原用滴管小心放入小孔中，將膠板放入電泳槽中并用潤濕的濾紙將膠板和電泳槽中的緩沖溶液相連。蓋上電泳槽蓋，接通電源，6V/cm通電至前沿移動(dòng)約35mm,時(shí)間約為1小時(shí)，利用示蹤染料判斷移動(dòng)距離。3-擴(kuò)散將膠板移出電泳槽并放在水平位置上,用濾紙潤干膠板凹槽中的緩沖溶液,在凹槽中加入適量的抗體(0.2ml0.25ml),注意抗體不能溢出凹槽以避免污染將膠板移至含有疊氮化鈉且有一定濕

15、度的盒內(nèi),加蓋密封后在30C水浴擴(kuò)散至少10小時(shí)后，移至0.85%鹽水中以終止擴(kuò)散并洗去未結(jié)合的蛋白?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】觀察抗原和抗體之間所形成的沉淀線，并進(jìn)行記錄?！舅伎碱}】1什么是抗原和抗體？并解釋抗原抗體結(jié)合的特點(diǎn)。2簡述免疫電泳的基本原理。Experiment21Preparation,PurificationofPolyclonalAntibodyandImmunoelectrophoresis【Purpose】Understandingthebasicacknowledgeofantibody.Masterthemethodsofpreparationandpurificationofp

16、olyclonalantibody.Understandtheprocedureandbasicprincipleofimmunoelectrophoresis.IPreparationofPolyclonalAntibody【Principle】Ifanantigenisinjectedintoananimal,anumberofantibody-producingcellswillbindthatantigen,albeitwithvaryingdegreesofaffinity,andsotheantibodywhichappearsinthebloodstreamwillhaveari

17、senfromseveralclonesofcells,thatisitwillbeapolyclonalantibody.Differentantibodymoleculesinapreparationofpolyclonalantibodywillbindtodifferentpartsofthemacromolecularantigen,whicharecalledepitopeandwilldosowithdifferentbindingaffinities.Theintroductionofanantigenintothetissueofasusceptibleanimalresul

18、tsinitiallyinincreasedproliferationoflymphocytesinthetissuesofthereticule-endothelialsystemparticularlythelymphnodesandthespleen.Ananimalwillshowdifferentresponsesforaprimaryresponseandasecondaryresponseasshowninthefigure.Antibodyisusuallydetectedintheserumfromaround7daysafterthefirstinjectionandper

19、sistsatalowlevelforafewdays,typicallyreachingpeaktiteraroundday10.Primaryresponsesoftenareveryweak,particularlyforreadilycatabolized,solubleantigens.Theresponsetothesecondinjectionofthesameantigenisdramaticallydifferent,itshowsaconsiderablyincreasedrateofantibodysynthesiscomparedwiththeprimaryrespon

20、seandtheantibodypersistsforalongerperiod.Thekineticsoftheresponsevariesdependingupontheantigenandtheanimalbuttherelationshipbetweentheprimaryresponseandthesecondaryresponsesischaracteristic.Theresponsetothirdandsubsequentinjectionsbroadlymirrorsthatofthesecondinjection.Highertitersofantibodyarereach

21、ed,butmoreimportantlythenatureandthequalityoftheantibodiespresentintheserumchange.Thesechangesareknownasthematurationoftheimmuneresponseandhaveconsiderablepracticalimportancebecausetheyyieldhigh-affinityantibodypreparations.Forrabbits,injectionsarenormallygivenevery46weeks.【Materials】Animal：Adultrab

22、bit.Apparatus:Strainer;razorblade;needlewith25gauage;1mlsyringe;20mlevacuatedbloodcollectiontube;Spatula;Centrifugeandplasticcentrifugetube;Pipettemanandtip;Beaker.ReagentAntigen;ethanol;20mMphosphatebufferedsaline(PBS)pH7.2;FreundscompleteandincompleteadjuvantThecomponentofFreundscompleteandincompl

23、eteadjuvantComponentcompleteadjuvantincompleteadjuvantParaffin6share+Dehydratedlanolin4share+Deadmycobacteria3mg5mg+-PBSbuffer10share+Thecompleteadjuvantmustbepreparedthroughaddingdeadmycobacteriainincompleteadjuvantjustbeforeyouneedit.AntibodylevelinserumWeeksafterinitialinjectionofantigen【Procedur

24、e】PreparationofantigenTheobjectofpreparingtheantigenistopresentittotheanimalinaformthatwillinducethestrongestandmostappropriateresponse.Usually,pureantigensprovidethebestcasefortheproductionofantibodies,sothepurificationofantigensisnecessarybeforeantigeninjection.Thestandardtechniques,includingcolum

25、nchromatography,differentialextraction,andsubcellularfractionationarethemostuseful.IfthepolypeptideofinterestcanbeseenasauniquebandonaSDS/PAGE,thenthegelcanbeusedasafinalpurificationstep.Pre-bleedCalmlyandgentlyplacerabbitinarestrainer.Iftheyarerelaxedtheybleedmucheasier.Bypressinglightlyonthebaseof

26、theear,thereturnofthebloodtothebodycanberestrictedandtheveinwillstandoutstraight.Inserttheneedleintothetopmiddleofearvein,whentheneedleappearstobeinthevein,gentlytrytowithdrawtheneedleandcollectblood.Whenyouhavetherequiredamountofblood(1ml5mlissufficientforapre-bleed),removetheneedleandapplypressure

27、tothewound.Whenthebleedinghasstopped(10seconds),sterilizetheearwithethanol.Removetherabbitfromtherestrainerandplaceitinitscage.Takethecollectedbloodandplaceat37Cfor30minutestoinactivatecomplement,placethetubeat4Covernighttoclot.Loosentheclotfromthetubewallwithaspatulaanddecantthebloodintoaplasticcen

28、trifugetube,centrifugeat4C10,000gfor10minutes.Collectthesupernatantandkeepat4C.AntigenInjectionForinjectionoftworabbits,antigenshouldbein1mlPBS.100卩g/rabbitofantigenisbest,butyoucanuselessandgetgoodresults.PrepareFreundsadjuvantbywarminginabeakerofwarmwater,injecting1mlofantigensolutionintotheadjuva

29、nt,andvortexingvigorouslyfor2minutestogetagoodsuspension.Drawantigen/adjuvantsolutionina3mlsyringe.Calmlytaketherabbitoutofitscageandplaceitonaflatsurfacefortheinjection.Foursubcutaneousinjectionsaredone,twoonthelowerbackandtwoonthethigh.Toinject,rubthehairawayfromtheinjectionsiteandsterilizewithasq

30、uirtofethanol.Pinchtheskinandpullupslightlytopulltheskinawayfromthemuscle,inserttheneedle1cm2cmata15degreeanglesoasnottohitmuscle,andinject500卩1ofyourinoculum.Aftertherequiredvolumehasbeeninjected,lettheneedleremainintheplaceforafewseconds,thenpullitoutandgentlyrubtheinjectionsitesonothingleaksout.R

31、epeatforallfoursitesandplacetherabbitbackinitscage.Repeattheprocessfortheotherrabbits.Injectionswillbedoneevery4weeks6weeks,withbleeds7days10daysaftereachinjectionaccordingtostep2.Bleedsareperformedidenticallytothepre-bleed,butobtainatleast20mlperrabbit,with40mlbeingtheupperlimitforanadultrabbittopr

32、eventanemia.4.BleedandcollectionCalmlyandgentlyplacerabbitinarestrainer.Rubxyleneonthetopmiddleoftheeartodilatethevein.Shavethispositionwitharazorbladeata45angletoformanotchwith0.23cm0.3cmlengthandcheckifthebloodcaneffusefreely.Collectthebloodbyallowingittodropintoasterilizedtube.Ifthebloodclotonthe

33、cutbeforethedesiredamountiscollected,wipetheearwithwarmcleanwaterandcontinuetocollect.Thebloodflowcanbestoppedbygentlypressuretothecutwithasterilepieceofgauze.Applypressurefor10to20secondsandthenchecktobesuretheflowhasstopped.Takethecollectedbloodandplaceat37Cfor30minutes,placethetubeat4Covernightto

34、contract.Loosentheclotfromthetubewallwithaspatulaanddecantthebloodintoaplasticcentrifugetube.Centrifugeat4C10,000gfor10minutes,decantorpipetoffthesupernatant.Thisistheantiserum,itcanbestoredformanyyearsat-20C.【Result】ChecktheresultofthisexperimentbyusingWestern-blottingorimmuno-precitpitationmethod.

35、IIPurificationofAntibodywithAffinityChromatography【Principle】Asshowninthefigure,theaffinitychromatographyisthemostpowerfultechniqueforproteinpurificationsinceitshighselectivitycan,inprinciple,allowpurificationofasingleproteinoflowabundancefromacrudemixtureofproteinsathigherconcentration.Secondly,ift

36、heaffinityoftheligandfortheproteinissufficientlyhigh,thetechniqueofferssimultaneousconcentrationfromalargevolume.Althoughformanypurposesitisnotnecessarytopurifytheantibodiesawayfromotherserumproteins,ifdesiredthisisbestaccomplishedbyProteinAaffinitychromatography.ProteinAfoundfromStaphylococcusaureu

37、scanbindtotheFcregionofimmunoglobulinsthroughinteractionswiththeheavychain.TheBindingofProteinAhasbeendocumentedforIgGfromavarietyofmammalianspeciesandforsomeIgMandIgAaswell.So,IfcoupleProteinAwithamatrix,suchassepharoseCL-4B,thiskindofresincanbeapowerfultooltoisolateandpurifyclasses,subclassesandfr

38、agmentsofimmunoglobulinsfrombiologicalfluidsandserum.+Coupleligandwithamatrix耘+oSpecificallybindwithtargetprotein+SeparatebindingproteinTheprocedureofaffinitychromatography【Materials】ApparatusProteinAcolumn(10mlor5mlofpackedbeads);pump;Centrifugetubesandmicrocentrifugetubes;preparativecentrifugeandm

39、icrocentrifuge;pHstrips;Microtiterplatereaderwith600nmfilter;GlassColumns.Reagent(1)Tris-bufferedsaline(TBS):Add6.06gTris(50mM),8.78gNaCl(150mM)以及0.5gNaN3(0.05%)to1LdistilledwaterandadjustpHto7.4withHCl.NeutralizationBuffer(NB):Add121.2gTris(1M),87.8gNaCl(1.5M),0.37gEDTA(1mM)and5gNaN3(0.5%)toLdistil

40、ledwaterandadjustpHto8.0withHCl.ElutionBuffer(pH2.7):Add3.75gGlycine(50mM)to1LdistilledwaterandadjustpHto2.7withHCl.ElutionBuffer(pH1.9):Add3.75gGlycine(50mM)to1LdistilledwaterandadjustpHto1.9withHCl.【Procedure】1PreparationofaProteinAsepharoseCL-4BAffinityColumnTypically,columnscontaining5mlor10mlof

41、packedproteinAsepharoseCL-4Bareprepared.Useapipettetotransferthedesiredvolumeofa50%proteinAsepharoseCL-4Bslurrytoavacuumflask,placeastopperinthevacuumflaskandapplyvacuumforatleast15minutesatroomtemperature.ThisstepremovesgasfromthesepharoseCL-4Bandisnecessarytopreventbubbleformationinthecolumnthatwo

42、uldreducethecolumnscapacityandresolution.SlowlyaddthedegassedproteinAsepharoseCL-4Btoaglasscolumn,packthecolumnataflowrateofabout1-2mlpermin.Donotletthecolumnrundry!Flowratemaybecontrolledbyusingapump.Washthecolumnwith10bedvolumesofice-coldTBS.Thisstepchillsthecolumn,whichreducesnonspecificbindingof

43、proteinsandslowsthemetabolismofanyremainingviablemicrobes.PreparationofAntiserumThawtheantiseruminicewaterortherefrigeratorovernighttopreventaggregationofproteins.Anyproteinaggregatethatformsduringthawingmaybedissolvedbybrieflywarmingthethawedantiserumto37C.Addsodiumazidetoafinalconcentrationof0.05%

44、.Clarifytheantiserumbycentrifugationat15,000 xgfor5minutesat4Candremovetheclarifiedantiserumthatliesbetweenthefloatinglipidandthepellet.Additionalfiltrationmayberequiredtoremoveresiduallipid.AffinityChromatographyDiluteAntibody1:5withBindingBufferandfilterthrougha0.22filter.Then,addthedilutedantiser

45、umtothecolumnataflowrateof0.5mlperminute.Passtheantiserumthroughthecolumntwiceandsavetheflowthroughincasetheantibodydidnotbindtothecolumn.WashcolumnwithTBSuntilA0.008andaddElutionBufferpH2.7tocolumnatarateof入280nmr0.5ml/minuntilallproteinhasbeenelutedfromthecolumncheckingwithspectrometer.Collectelut

46、edantibodywith1.5mlmicrocentrifugetubeswhichhavebeenadded100ulofNeutralizationBuffer(NB)andmixeachtubimmediatelyandplaceonicetopreventdenaturationoftheIgG.Add10mlofElutionBufferpH1.9tothecolumn;collect,mix,andsavefractionsasdescribedinstepabove.ContinuetocollectproteinuntilA280nm(li?scro$-liriktlica

47、nd伽m血i附olubluccinplex【Materials】ApparatusHorizontalelectrophoresisapparatus;Drillingequipment;Glassplate;Razorblade;Powersupply;Waterbath(55C);Distilledwater;Beaker(400-600ml);Micropipetteandtips(5ul100ul).ReagentPurifiedantibody;proteinmixture;1%agarose.Tris-ethylbarbitalbuffer:2.24gethylbarbitalac

48、id,4.43gTris,0.053gCa2+salineoflactate,0.065gsodiumazide,in100mldistilledwater.Electrophoresisbuffer:1:4diluteTris-ethylbarbitalbufferwithdistilledwater【Method】1PreparationofagarosegelMixagarosepowerwithelectrophoresisbufferandheatin90Cwaterbathuntildissolvetomake1%agarosegel.Spreadgelinhorizontalgl

49、assplatebeforefreeze.Afterthegelcooltoroomtemperature,punctureporeswith4mminternaldiameterdrillingequipmentandmakethetroughwithrazoraccordingthefigure.ElectrophoresisAdd4%-5%antigen,whichisdilutedwithelectrophoresisbufferintothesmallholeswithglasspipetteandputtheagarplateintheelectrophoresischamber.

50、Communicatetwoendsofplatetothebufferinthecamberwithwettedfilterpaperandputthecoveronthechamber.Connectpowersupply,electrophoreseatthe6V/cmfor1hrwithamigrationdistanceof35mmandthedistancecanbeverifiedbyobservingthepositionofmarker.DiffusionRemovetheagarplatefromthechamberandputitonaflatsurface.Getrid

51、ofthebufferintroughwithfilterpaperandapplyappropriateamountofantibody(0.2-0.25ml)inthetrough,Severeoverfillingmaycausecontamination.Stacktheplateinahumiditychambercontainingsodiumazide,incubatetheplateat30Cwaterbathforatleast10hours.Transfertheplateto0.85%saline,whichcanstopthediffusionandwashoutunb

52、oundproteins.【Result】Observetheprecipitationlinewhichisformedbyantigencombiningwithantibody.【Question】1.Whatisantigenandantibody?Whatisthecharacteristicoftheircombinationwitheachother?2Whatisthebasictheoryofimmunoelectrophoresis?單克隆抗體制備方法單克隆抗體制備方法1975年Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的

53、雜交瘤細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無性繁殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破使血清學(xué)的研究進(jìn)入了一個(gè)高度精確的新紀(jì)元。采用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體包括動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、選擇雜交瘤、檢測抗體、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)，要經(jīng)過幾個(gè)月的一系列實(shí)驗(yàn)步驟。主要儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)、CO2恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱（-70C）、倒置顯微鏡、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機(jī)（水平轉(zhuǎn)子，4000r/min）、37C水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，10ml、1ml刻度吸管，試管，滴管（彎頭、直頭），平皿，燒杯，5

54、00ml、250ml、100ml鹽水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，融合管（50ml圓底帶蓋玻璃或塑料離心管），眼科剪刀，眼科鑷，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，可調(diào)微量加樣器（50ul，200ul，1000ul），彎頭針頭，200目篩網(wǎng)，小鼠固定裝置等。此外，一般的單克隆抗體制備方法大同小異。方法動(dòng)物的選擇與免疫動(dòng)物的選擇BALB/C小鼠，較溫順，離窩的活動(dòng)范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環(huán)境潔凈的實(shí)驗(yàn)室均能飼養(yǎng)成活。目前開展雜交瘤技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室多選用純種BALA/C小鼠。免疫方案選擇合適的免疫方案對(duì)于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般在融合前兩

55、個(gè)月左右根據(jù)確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。（1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應(yīng)先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。初次免疫抗原150pg加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射或脾內(nèi)注射（一般0.81ml,0.2ml/點(diǎn)）J3周后第二次免疫劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內(nèi)注射）（ip劑量不宜超過0.5ml）J3周后第三次免疫劑量同一，不加佐劑，ip（57天后采血測其效價(jià)）J23周加強(qiáng)免疫，劑量50500pg為宜，ip或iv（靜脈內(nèi)注射）J3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，女如將

56、可溶性抗原顆?；蚬滔嗷?，一方面增強(qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)抗原的反應(yīng)性。（2）顆?？乖庖咝詮?qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細(xì)胞性抗原為例，免疫時(shí)要求抗原量為12x107個(gè)細(xì)胞。初次免疫1x107/0.5mlip4G+X7J23周后第二次免疫1x107/0.5mlJ3周后加強(qiáng)免疫（融合前三天）1x107/0.5mlip或ivJ9取脾融合T細(xì)胞融合細(xì)胞融合前準(zhǔn)備.骨髓瘤細(xì)胞系的選擇：骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品

57、系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。常用的骨髓瘤細(xì)胞系見下表。用于融合試驗(yàn)的主要骨髓瘤細(xì)胞系名稱來源耐藥Ig鏈HLP3/X63-Ag8(X63),j:I7M)z*?#PI6R!nBALB/C骨髓瘤MOPC-210h!f.8y7|5YA/QE)K(HN38-氮鳥嘌吟9Pp.E,w(W3p)J-W8R|r1K/09G-+j%Y5J7F4pP3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)E1?5V&u;f6Y6R&L#V3O2iP3/X63-Ag86N/Q(J$w33h8;B:Z$G8-氮鳥嘌吟qi-N5M.H?(p$S;e9J(O1vZ3D&a6d!gV8E-8r5Y9A:M2B06QP3/NSI

58、-1-Ag4-1(NS-1).Y+V+D;Z6pN91dT;cyP3/X63-Ag83f#t;Q$b*nE3/y+Oc8-氮鳥嘌吟*B66j9o(h,S-H0WK(不分泌型)7.L)Oa&6|/WP3/X63-Ag8.UI(P3UI)+X0Ye8,m4s(X63xBALB/C脾細(xì)胞)雜交瘤p；?+m7D+h.g9W!A5f2I8-氮鳥嘌吟8X5H#e!X%g3d(S#I-o-m#:N:M(z$h$X(c/:L+f5f5Q5_8OSP2/0-Ag14(SP2/0)（X63xBALB/C脾細(xì)胞）雜交瘤8-氮鳥嘌吟h5m&A9o+8v7q1?5O-P+c2+s#W2w6U3O)q5k4V!n*A!T

59、,N;z/|)mu5o9M$w;I.r.g%AF0.aZ.R#U$p,d$s,BALB/C骨髓瘤08-氮鳥嘌吟/V97J1hH;y$3O3KQ:y%y.A6yi+/B*r/j(S%Cu$Rp:L(U16A;h;s+bDS194/5.XXO.BU.1P3/X63-Ag85-溴脫氧尿嘧啶!H4f%n/mR;o$PB7Y+N6E$*k&c/E8e$r)-G3N!r,T-i+V.B&b核苷h|;n9F5F5i2fV/s:O!X4-rG*HMPC11-45.6TG1.7-O.Gm&0L*FBALB/C骨髓瘤MPC-11,_.5V!t$o%i6-巰鳥嘌吟000h,w!-s(I$U)A$b1N-N;rr2b

60、K/R1nr,n3o(n210.RCY3.Ag1.2.3LOU大鼠骨髓瘤R2108-氮鳥嘌吟KM0L%69A6t,$Q.y$o%QY7Q$N)X+j;j&m!U.V-h.n$u-Z$IWGM15006TG-A12:zr.u8y!_人骨髓瘤GM1500%W%C#o4C)R4r?8DC6-巰鳥嘌吟3N,s!u6m/B%1r1K3w.IR0u9O1e1OU-266AR8-;i:U(g人骨髓瘤U-266+f#I8z(J0Z9Y(r8-氮鳥嘌吟.-R5be1H$J73H,k4N*f入)N.Ia709V;m,?3r骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可用一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640,DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在1