假奓包葉抗菌活性部位提取工藝研究

1、假奓包葉抗菌活性部位提取工藝研究【摘要】目的挑選假奓包葉抗菌活性部位的最正確別離工藝。方法以沒食子酸為檢測指標，采用HPL測定沒食子酸的含量，對假奓包葉的提取別離工藝進展研究。結(jié)果最正確工藝為：以水作為溶劑，采用溫浸法提取，原料粉碎為中粉，液料比201(gl)，提取溫度為50，提取時間8h,提取1次。結(jié)論該提取別離方法進步了假奓包葉的利用率，且簡便可行，提取物具有抗菌活性，可用于工業(yè)消費?！娟P(guān)鍵詞】抗菌活性部位;假奓包葉;提取工藝假奓包葉又名金沙葉、艾桐、老虎麻，原植物為大戟科假奓包葉屬植物假奓包葉DislEidinrufesens(Franh.)PaxetHff.，主產(chǎn)于陜西、甘肅、湖北、湖

2、南、川貴等地1。民間以根皮入藥，具有清熱解毒、泄水消積的成效，用于治療水腫、食積、毒瘡、鵝掌風(fēng)等癥2。在對其化學(xué)成分研究中發(fā)現(xiàn)，該植物中含有的構(gòu)造類型包括黃酮類、有機酸類、三萜類和蒽醌類化合物等，其中，沒食子酸的含量較高，且該化合物具有抗菌、殺錐蟲、抗腫瘤、去除自由基和抗氧化等藥理活性36。故本研究以沒食子酸含量作為指標，對假奓包葉葉中的抗菌活性成分的提取工藝進展初步研究和討論。1儀器與試藥L-2022A型高效液相色譜儀(日本島津公司);AE240S型電子分析天平(瑞士ETTLER公司);HS6150D超聲振蕩儀(天津市恒奧科技開展有限責(zé)任公司);RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);

3、HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器);SHZ-D循環(huán)水真空泵(河南鞏義市英峪予華儀器廠)。假奓包葉采于陜西漢中地區(qū)，經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系天然藥物化學(xué)研究室王軍憲教授鑒定為大戟科植物假奓包葉DislEIdinrufesens(Franh.)PaxetHff.的葉;沒食子酸對照品(實驗室自制，純度98%);高效液相用甲醇為色譜純;蒸餾水自制;其余試劑均為分析純。2方法與結(jié)果2.1含量測定2.1.1色譜條件色譜柱為DikaDiansil18柱(4.6250，5)，流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液(595)，檢測波長為269n;流速為1.0lin-1;柱溫為25。2.1.2對照品儲藏液的制備精細

4、稱取沒食子酸對照品21.8g，置于50l的容量瓶中，用甲醇配成濃度為0.436gl-1的對照品儲藏液，備用。2.1.3供試品溶液制備取枯燥假奓包葉葉粗粉1g，精細稱定，置具塞錐形瓶中，精細參加蒸餾水20l，50下溫浸提取8h，放冷，搖勻，濾過，精細汲取續(xù)濾液5l至蒸發(fā)皿中，蒸干，殘渣用甲醇轉(zhuǎn)移并定容至5l容量瓶內(nèi)，搖勻，經(jīng)0.45微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。2.1.4標準曲線及線性關(guān)系考察精細汲取對照品儲藏液0.10，0.80，1.60，2.50，3.75，5.00l，分別置10l量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，分別精細汲取上述溶液各10l，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，以沒食子酸對照品濃

5、度(gl-1)為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為Y=3107X+50865(r=0.9996)，說明沒食子酸的濃度在0.0040.2180gl-1與峰面積呈良好的線性關(guān)系。2.1.5精細度實驗精細汲取上述“2.1.4項濃度為0.1090gl-1的對照品溶液，重復(fù)進樣5次，10l/次，平均峰面積為386573，RSD為0.44%，說明儀器精細度良好。2.1.6重復(fù)性實驗取同批號的假奓包葉葉樣品5份，依法制備供試品溶液，按擬定的色譜條件進展測定，并按外標法計算，結(jié)果測定沒食子酸的平均含量為0.427%，RSD為2.17%。2.1.7穩(wěn)定性實驗取沒食子酸對照品溶液，分別在0，2

6、，4，6，8，12，24h進樣1次，依法測定，平均峰面積為3105072，RSD為0.60%，說明沒食子酸穩(wěn)定性較好。2.1.8加樣回收率實驗精細稱取假奓包葉葉粗粉1g(相當于沒食子酸約0.2g)，準確參加0.2g沒食子酸對照品，按“2.1.3項下方法制備供試品5份，分別進樣10l，測定峰面積，計算加樣回收率。結(jié)果平均回收率為100.6%，RSD為1.68%。2.2提取工藝首先對提取溶劑和提取方法進展了挑選，并在此根底上采用正交法對提取工藝進展優(yōu)眩選取5個對提取率影響較大的因素(粉碎度、液料比、溫度、時間和次數(shù))、每個因素選擇3個程度進展考察，按L18(37)表安排實驗，以沒食子酸的含量為實驗

7、指標，挑選抗菌部位的最正確提取工藝。2.2.1提取溶劑的選擇取1g假奓包葉粗粉3份，精細稱定，分別置100l圓底燒瓶中，各參加蒸餾水、95%乙醇、70%酸性乙醇(用鹽酸調(diào)pH值為2)30l，置水浴鍋中回流提取2h，提取1次。提取完畢，過濾，精細汲取續(xù)濾液5l置蒸發(fā)皿中，在80水浴中蒸干，用甲醇溶解剩余物，轉(zhuǎn)移并定容至5l容量瓶中，經(jīng)微孔濾膜過濾后，按“2.1項下含量測定方法測定其含量，并按以下公式計算沒食子酸的產(chǎn)率。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.沒食子酸的產(chǎn)率(%)=沒食子酸含量(gl-1)體積(l)藥材重量(g)100%2.2.2提取方法的選擇取1g假奓包葉粗粉3份，精細稱定，置100l圓底燒瓶中，

8、依次參加蒸餾水30l，分別采用冷浸法(常溫)、溫浸法(40)、煎煮法提取，提取時間均為2h，提取1次。提取完畢，過濾，精細汲取各續(xù)濾液5l置蒸發(fā)皿中，在80水浴中蒸干，用甲醇溶解剩余物，轉(zhuǎn)移并定容至5l容量瓶中，經(jīng)微孔濾膜過濾后，按“2.1項下含量測定方法測定其含量，并按“2.2.1項下公式計算沒食子酸的產(chǎn)率(%)。2.2.3正交實驗根據(jù)數(shù)次預(yù)試結(jié)果，采用溫浸法(4060)，以水作為溶劑提取假奓包葉葉中的抗菌活性部位。為了進一步優(yōu)選最正確的提取工藝，采用正交實驗L18(37)設(shè)計安排實驗，以沒食子酸的產(chǎn)率為指標，詳細考察藥材粉碎度、液料比(gl)、溫浸溫度、時間及次數(shù)5個因素，每個因素選3個程

9、度，詳細因素程度見表1。表1正交實驗因素程度精細稱取枯燥的假奓包葉1g，共18份，按正交實驗設(shè)計表(見表2)溫浸提齲提取液過濾，分別精細量取各次提取液5，10，15l至蒸發(fā)皿中，蒸干，剩余物用甲醇轉(zhuǎn)移并定容至5l容量瓶內(nèi)。按“2.1項下的含量測定方法測定樣品溶液中沒食子酸的濃度(gl-1)，并按“2.2.1項下公式計算沒食子酸的產(chǎn)率(%)。詳細實驗安排、結(jié)果和方差分析見表23。表2L18(37)正交實驗安排及結(jié)果表3正交實驗方差分析從表2的實驗結(jié)果分析可以看出，在實驗考察范圍內(nèi)，各因素對沒食子酸含量的影響程度大小次序為：DEAB。提取時間對提取液中沒食子酸產(chǎn)率影響最大，液料比對產(chǎn)率的影響最校從

10、表3的正交實驗方差分析可以看出，在實驗考察范圍內(nèi)，僅提取時間因素各程度間具有顯著性差異。結(jié)合實際操作，最終確定以沒食子酸為指標的抗菌部位提取的最正確工藝條件是A2B12D3E1，即以水作為溶劑，采用溫浸法提取，原料粉碎度為中粉，液料比為201，提取溫度為50，提取時間8h，提取1次。2.2.4提取物抗菌作用驗證采用擴散法對所得提取物的體外抗菌活性進展檢測。以金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌作為供試菌，用打孔器將定量濾紙制成直徑6的圓形小紙片，經(jīng)高壓滅菌處理，37烘干后，備用。采用劃線法將供試菌株密集接種于營養(yǎng)瓊脂平板，取一張濾紙片蘸取樣本，緊貼于已接種過供試菌的平板外表，做好標記。置4下作用12h，

11、于37，48h培養(yǎng)后測定抑菌環(huán)直徑。結(jié)果顯示，該提取物的抑菌環(huán)直徑均在810之間，具有一定的體外抗菌活性。3討論有文獻報道用酸醇提取藥材中的多酚類物質(zhì)7，故我們也將這種方法列入至提取溶劑的考察中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酸水提取液中的沒食子酸含量較低，說明沒食子酸在酸性條件下不穩(wěn)定，不宜在酸性條件下提齲實驗同時也考察了堿性條件下沒食子酸的穩(wěn)定性，取濃度為0.1267gl-1的沒食子酸對照品甲醇溶液，用4%NaH調(diào)pH為12，密塞后于60下靜置0.5h，測定靜置前后沒食子酸的含量，結(jié)果顯示靜置后無法測出沒食子酸的色譜峰，說明沒食子酸在堿性下不穩(wěn)定，不宜在堿性條件下提齲在預(yù)試和正交實驗的根底上，我們初步挑選出假

12、奓包葉中抗菌活性部位的提取工藝，通過體外抗菌實驗驗證，證實其具有一定的抑菌活性。該方法簡便可行，可用于工業(yè)消費?！緟⒖嘉墨I】1中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志，四十四卷，第3分冊.北京：科學(xué)出版社，1979：64.2中國藥材公司.中國中藥資源志要.北京：科學(xué)技術(shù)出版社，1994：625.3Nse，KideT，rikaaK，etal.FratinfreativexygeninterediatesightbeinvlvedinthetrypanidalativityfgalliaidJ.BilPharBull，1998，21(6)：583.4hnT，Inue，giharaY.yttxiativityfgalliaidagainstliveretastasisfellsP815J.Antianer-Res，2001，21(61A)：3875.5QiuX，TakeuraG，Kshiji，etal.GalliaidinduesvasularsthusleelldeathviahydrxylradialprdutinJ.HeartVessels，2000，15(2)：90.6Ys