DB11-T375-2017水生動(dòng)物檢疫名錄及病原檢測(cè)方法

1、ICS 65.150B 50備案號(hào):54157-2017DB11北京市地方標(biāo)準(zhǔn)DB11/T 3752017代替 DB11/T 375-2006水Th動(dòng)物檢疫名錄及病原檢測(cè)方法List of aquatic animal diseases and its detection method2017 - 03 - 22 發(fā)布2017 - 07 - 01 實(shí)施北京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā) 布DB11/T 3752017前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.12009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)替代DB11/T 3752006水生動(dòng)物檢疫名錄及病原檢測(cè)方法，與DB11/T 3752006相比， 除編輯性修改外主要技術(shù)變化如下

2、：修改了標(biāo)準(zhǔn)適用范圍(見(jiàn) 1)；修改了檢疫名錄(見(jiàn) 3,2006 年版的 3)；修改了病原檢測(cè)方法（見(jiàn) 4.2,2006 年版的 4）；刪除了資料性附錄 A、B、C、D、E、F、G、H、I、J（見(jiàn) 2006 年版的附錄 A、B、C、D、E、F、G、H、I、J）；刪除了結(jié)果報(bào)告單（見(jiàn) 2006 年版的 5）；增加了采樣、抽樣規(guī)格、抽樣水溫的規(guī)定(見(jiàn) 4.1)；增加了資料性附錄 A“鯽造血器官壞死病診斷規(guī)程” （見(jiàn)附錄 A）。請(qǐng)注意文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專(zhuān)利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由北京市農(nóng)業(yè)局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由北京市農(nóng)業(yè)局組織實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站

3、。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：曹歡、王姝、王小亮、王靜波、曹潔、徐立蒲、那立海、賈麗、張文、王澎。本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為:DB11/T 3752006。IDB11/T 3752017水Th動(dòng)物檢疫名錄及病原檢測(cè)方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)給出了水生動(dòng)物檢疫名錄及病原檢測(cè)的方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于水生動(dòng)物檢疫以及相關(guān)疫病的監(jiān)測(cè)。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T15805.1魚(yú)類(lèi)檢疫方法 第1部分：傳染性胰臟壞死病毒(IPNV)GB/T15805.2魚(yú)類(lèi)檢疫方法 第2

4、部分：傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)GB/T15805.4魚(yú)類(lèi)檢疫方法 第4部分：斑點(diǎn)叉尾鮰病毒(CCV)GB/T15805.5魚(yú)類(lèi)檢疫方法 第5部分：鯉春病毒血癥病毒(SVCV)SC/T7103水生動(dòng)物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范SC/T7212.1鯉皰疹病毒檢測(cè)方法 第1部分：錦鯉皰疹病毒SN/T2503淡水魚(yú)中寄生蟲(chóng)檢疫技術(shù)規(guī)范SN/T3584草魚(yú)出血病檢疫技術(shù)規(guī)范檢疫名錄檢疫對(duì)象及其相應(yīng)的檢疫范圍見(jiàn)表1。表1檢疫名錄序號(hào)檢疫對(duì)象檢疫范圍1鯉春病毒血癥（Spring viraemia of carp，SVC）鯉魚(yú)、錦鯉、金魚(yú)等鯉科魚(yú)類(lèi)2草魚(yú)出血?。℉emorrhage disease of

5、grass carp，GCRV）青魚(yú)、草魚(yú)3傳染 性 造 血 器官 壞死 ?。?Infectious haematopoieticnecrosis ,IHN）虹鱒等冷水性鮭科魚(yú)類(lèi)4錦鯉皰疹病毒?。↘oi herpesvirus disease，KHVD）鯉、錦鯉5鯽造血器官壞死?。℅oldfish haematopoietic necrosis ,GFHN）金魚(yú)、鯽6傳染性胰臟壞死?。↖nfectious pancreatic necrosis ,IPN）虹鱒等冷水性鮭科魚(yú)類(lèi)7斑點(diǎn)叉尾鮰病毒?。╟hannel catfish virus disease ,CCVD）斑點(diǎn)叉尾鮰8小瓜蟲(chóng)病（Ich

6、thyophthiriasis）淡水魚(yú)類(lèi)病原檢測(cè)采樣方法1DB11/T 3752017采樣按照SC/T 7103的規(guī)定執(zhí)行，抽樣規(guī)格及抽樣水溫見(jiàn)表2。表2抽樣規(guī)格及抽樣水溫序號(hào)檢 疫 對(duì) 象抽樣 規(guī) 格抽樣 水 溫1鯉春病毒血癥苗種或成魚(yú)10202草魚(yú)出血病苗種或成魚(yú)20303傳染性造血器官壞死病6 月齡以下苗種8154錦鯉皰疹病毒病苗種或成魚(yú)20305鯽造血器官壞死病苗種或成魚(yú)15266傳染性胰臟壞死病3 月齡以下苗種10147斑點(diǎn)叉尾鮰病毒病苗種或成魚(yú)25308小瓜蟲(chóng)病苗種或成魚(yú)1525檢測(cè)方法病原檢測(cè)方法見(jiàn)表3。表3檢測(cè)方法序號(hào)檢 疫 對(duì) 象檢 測(cè) 方 法1鯉春病毒血癥GB/T 1580

7、5.52草魚(yú)出血病SN/T 35843傳染性造血器官壞死病GB/T 15805.24錦鯉皰疹病毒病SC/T 7212.15鯽造血器官壞死病見(jiàn)附錄 A6傳染性胰臟壞死病GB/T 15805.17斑點(diǎn)叉尾鮰病毒病GB/T 15805.48小瓜蟲(chóng)病SN/T 25032DB11/T 3752017附錄A（資料性附錄）鯽造血器官壞死病診斷規(guī)程病原鯽造血器官壞死病毒（Goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV）。樣品要求水溫采集樣品時(shí)的水溫應(yīng)在1526。品種采樣品種為金魚(yú)、鯽及其雜交種。優(yōu)先采集金魚(yú)，其次為鯽魚(yú)，及其它雜交品種。數(shù)量按照SC/T 7103 執(zhí)行

8、。狀態(tài)已死亡魚(yú)樣不采集。信息采集需采集金魚(yú)、鯽及其雜交種發(fā)病情況、混養(yǎng)其它魚(yú)類(lèi)發(fā)病情況、采樣水溫等信息。臨床癥狀及流行病學(xué)特征臨床癥狀患金魚(yú)造血器官壞死病的金魚(yú)、鯽，特別是雜交種，具有下列臨床癥狀：最顯著的特征為鰓部嚴(yán)重充血, 瀕死病魚(yú)鰓部開(kāi)始大量出血，血液不斷的順著鰓絲流到體外；體表、下頜等處分布大量點(diǎn)狀出血點(diǎn)；病魚(yú)沒(méi)有生氣，不吃食，在水面緩游，病情嚴(yán)重時(shí)由于嚴(yán)重貧血使得鰓明顯退色，皮膚和鰓上有白色斑塊，癥狀和錦鯉發(fā)生的錦鯉皰疹病毒病不同；將病魚(yú)解剖后可見(jiàn)其肝發(fā)白，脾和腎腫大，脾上有白色結(jié)節(jié)。流行病學(xué)特征患金魚(yú)造血器官壞死病的金魚(yú)、鯽，特別是雜交種，具有下列流行病學(xué)特征：GFHNV 具有較高

9、的傳染性，但它的感染譜較小，僅感染金魚(yú)、鯽，特別是雜交種；該病流行的水溫適宜范圍為 1526，即當(dāng)池塘水溫自然上升至 15時(shí)，疾病開(kāi)始發(fā)生，而繼續(xù)上升至 26以上時(shí)，這種疾病發(fā)生率會(huì)大幅度下降；而當(dāng)秋季溫度開(kāi)始下降，特別是降3DB11/T 3752017低到 26以下時(shí)會(huì)再次流行；該病嚴(yán)重時(shí)死亡率較高(可以達(dá) 90%以上)；被感染的魚(yú)可以長(zhǎng)期帶毒。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)試劑和材料水：符合GB/T 6682中一級(jí)水的規(guī)格。GFHNV陽(yáng)性樣品：符合國(guó)家有關(guān)規(guī)定。Taq酶：20保存，不能反復(fù)凍融或溫度劇烈變化。dNTP：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10 mmoL/L。MgCl2：25 mmoL/L

10、。引物：濃度為100 pmoL/L。其序列如下：CyHV-pol-F：5-CCCAGCAACATGTGCGACGG-3；CyHV-pol-R：5-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3。擴(kuò)增 CyHV 1-3 型 pol 基因 362 bp 片段。引物：濃度為100 pmoL/L。其序列如下：GFHVN-F：5-CTACACGCCTCGCATCAT-3；GFHVN-R：5-CTCCACGGTCCTCATCTT-3。擴(kuò)增 GFHNV DNA helicase 基因 451 bp 片段。器材和設(shè)備普通冰箱和超低溫冰箱。組織研磨器。離心機(jī)和離心管。PCR擴(kuò)增儀。水平電泳儀。微量移液器及吸頭。紫

11、外觀察燈或凝膠成像儀。樣品處理取腎、脾、鰓和腦組織，成熟雌魚(yú)還需取卵巢液。將所取樣品勻漿成糊狀，按1：10的最終稀釋度懸于磷酸鹽緩沖液或M199細(xì)胞培養(yǎng)液。DNA抽提CTAB+酚/氯仿/異戊醇抽提法將450L懸液放入1.5mL的離心管，再加入450L CTAB溶液并混勻，25作用2小時(shí)。在含有樣品的離心管中加入600L抽提液，用力混合。12000r/min離心5min，取上層水相（約800L）。再加入700L抽提液，用力混合。12000r/min離心5min，取上層水相（約600L）。再加入預(yù)冷的1.5倍體積的無(wú)水乙醇（約900L），倒置數(shù)次混勻后，放置離心管于20下，至少8h后取出。1200

12、0r/min 離心30min，倒去上清液。將離心管倒置于吸水紙上，吸干液體。加11L DEPC水溶解后，作為PCR模板。4DB11/T 3752017DNAzol抽提法將100L懸液放入1.5ml的離心管，再加入1ml DNAzol，顛倒混勻5次，室溫下靜置5min，10600g（11400r/min）離心10min；吸取上清約1ml，加入0.5ml無(wú)水乙醇，顛倒混勻5次，室溫下靜置5min，18000g（15000r/min）離心30min；吸棄上清，加入500L 75%的乙醇清洗，18000g（15000r/min）離心5min； 吸棄乙醇，干燥5min；加入50L DEPC水（60預(yù)熱）

13、，60保溫5min；即為提取的DNA，作為PCR 模板。DNA提取試劑盒抽提法具體參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。DNA擴(kuò)增擴(kuò)增CyHV pol基因反應(yīng)體系為100L：在0.2mL反應(yīng)管中加入10L模板、 2.5L dNTP、10 L 氯化鎂溶液、10L 10倍Taq酶緩沖液、CyHV-pol-R和CyHV-pol-F各1L、2.5U Taq酶、加DEPC水至100L。將反應(yīng)管置于PCR擴(kuò)增儀。反應(yīng)程序：94變性5min；94變性1min、60退火1min、72 延伸1min，40次循環(huán)；72延伸10min；4保溫。擴(kuò)增GFHNV DNA helicase基因的反應(yīng)體系為100L：在0.2mL反應(yīng)管中加入1

14、0L模板、2.5 L dNTP、10L氯化鎂溶液、10L 10倍Taq酶緩沖液、GFHNV-R和GFHNV-F各1L、2.5U Taq酶、加D EPC水至100L。將反應(yīng)管置于PCR擴(kuò)增儀。反應(yīng)程序：94變性5min；94變性1min、55退火1min、72延伸1min，40次循環(huán)；72延伸10min；4保溫。設(shè)立對(duì)照在6.3樣品處理過(guò)程中應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性樣品對(duì)照、陰性樣品對(duì)照、空白對(duì)照。取GFHNV陽(yáng)性樣品抽提核酸作為陽(yáng)性對(duì)照。取正常的魚(yú)組織抽提核酸作為陰性對(duì)照。取等體積的水代替模板作為空白對(duì)照。瓊脂糖電泳用TBE電泳緩沖液，配制1.5%的瓊脂糖平板（含1L/mL EB）。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒(méi)膠面。將6L樣品和2L上樣緩沖液，按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時(shí)使用核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)參考物作對(duì)照。5V/cm電泳約0.5h,當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)底部時(shí)停止。在紫外觀察燈下或用凝膠成像儀觀察擴(kuò)增帶并判斷結(jié)果。測(cè)序取362bp DNA片段PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因序列測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中參考序列進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)果判定PCR后陽(yáng)性對(duì)照會(huì)出現(xiàn)一條362 bp