實驗操作指導(dǎo)書：蔗糖酶各級分活性及蛋白質(zhì)含量的測定

1、（三）蔗糖酶各級分活性及蛋白質(zhì)含量的測定一、實驗?zāi)康?掌握蔗糖酶活性測定方法，了解各級分酶的純化情況。二、原理為了評價酶的純化步驟和方法，必須測定各級分酶活性和比活。測定蔗糖酶活性的方法有許多種，如費林試劑法、Nelsons試劑法、水楊酸試劑法等，本實驗先使用費林試劑法，以后測米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax時再用Nelsons試劑法。費林試劑法靈敏度較高，但數(shù)據(jù)波動較大，因為反應(yīng)后溶液的顏色隨時間會有變化，因此加樣和測定光吸收值時最好能計時。其原理是在酸性條件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成一分子葡萄糖和一分子果糖。這些具有還原性的糖與堿性銅試劑混合加熱后被氧化，二價銅被還原成棕紅色氧化亞銅沉

2、淀，氧化亞銅與磷鉬酸作用，生成蘭色溶液，其蘭色深度與還原糖的量成正比，于650nm測定光吸收值。三、試劑 1. 堿性銅試劑（用畢回收） 稱10g無水NaCO3 ,加入100ml去離子水溶解，另稱1.88g酒石酸，用100ml去離子水溶解，混合二溶液，再加入1.13克結(jié)晶CuSO4，溶解后定容到250ml。 2. 磷鉬酸試劑（用畢回收） 在燒杯內(nèi)加入鉬酸17.5g，鎢酸鈉2.5g，10% NaOH 100ml, 去離子水100ml，混合后煮沸約30min（小心不要蒸干），驅(qū)去鉬酸中存在的氨，直到無氨味為止，冷卻后加85%磷酸63ml,混合并稀釋到250ml。 3. 0.25%苯甲酸200ml，配

3、葡萄糖用，防止時間長溶液長菌，也可以用去離子水代替。 4. 葡萄糖標準溶液： （1）貯液：精確稱取無水葡萄糖（應(yīng)在105恒重過）0.1802克，以0.25%苯甲酸溶液溶解后，定容到100ml容量瓶中（濃度10mmol/L）。 （2）操作溶液：用移液管取貯液10ml，置于50ml容量瓶中，以用0.25%苯甲酸或去離子水稀釋至刻度（濃度為2mmol/L）。 5. 0.2mol/L蔗糖溶液50ml，分裝于小試管中冰凍保存，因蔗糖極易水解，用時取出一管化凍后搖勻。 6. 0.2mol/L乙酸緩沖液，pH4.9，200ml。 7. 牛血清清蛋白標準蛋白質(zhì)溶液（濃度范圍：200500g/ml，精確配制50

4、ml）。 8. 考馬斯亮蘭G-250染料試劑，100mg考馬斯亮蘭G-250全溶于50ml 95%乙醇后，加入120ml 85%磷酸，用去離子水稀釋到1L（公用）。四、儀器 1. 試管20支，試管架1個 2. 秒表1塊，或用手表。 3. 移液管：0.1、0.2、2.0、5.0ml 4. 塑料可見比色杯（杯上和器皿染色后可用少量95% 的乙醇蕩洗） 5. 水浴鍋 6. 電爐 7. 保鮮膜 8. 橡皮筋五、各級分蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮蘭染料法（Bradford法）的微量法測定蛋白質(zhì)含量，參見 實驗“蛋白質(zhì)含量的測定法”（因Tris會干擾Lowry法的測定）。標準蛋白的取樣量為0.1、0.2

5、、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0ml，用去離子水補足到1.0ml。各級分先要仔細尋找和試測出合適的稀釋倍數(shù)，并詳細記錄稀釋倍數(shù)的計算（使用移液管和量筒稀釋）。下列稀釋倍數(shù)僅供參考： 粗級分 I： 1050倍 熱級分II： 1050倍 醇級分III： 1050倍 柱級分IV： 不稀釋 確定了稀釋倍數(shù)后，每個級分取3個不同體積的樣進行測定，然后取平均值，計算出各級分蛋白質(zhì)濃度。六、級分I、II、III蔗糖酶活性測定 用0.02mol/L pH4.9乙酸緩沖液（也可以用pH56的去離子水代替）稀釋各級分酶液，試測出測酶活合適的稀釋倍數(shù)： I ： 100010000倍 II ： 100

6、010000倍 III ： 100010000倍 以上稀釋倍數(shù)僅供參考。 按“表1”的順序在試管中加入各試劑，進行測定，為簡化操作可取消保鮮膜封口，沸水浴加熱改為用9095水浴加熱810min。七、柱級分IV酶活力的測定 1. 酶活力的測定參照“表1”設(shè)計一個表格，反應(yīng)混合物仍為1ml。 2. 第1管仍為蔗糖對照，9、10管為葡萄糖的空白與標準，與“表1”中的11、12管相同。 3. 27管加入柱級分IV（取樣前先試測出合適的稀釋倍數(shù)），分別為0.02 ml、0.05 ml、0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml和0.6ml，然后各加0.2ml乙酸緩沖液（0.2mol/L pH4.9），每管

7、用去離子水補充到0.8ml。 4. 17管各加入0.2 ml 0.2mol/L的蔗糖，每管由加入蔗糖開始計時，室溫下準確反應(yīng)10min，立即加入1ml堿性銅試劑中止反應(yīng)，然后按“表1”中的步驟進行測定。 5. 第8管為0時間對照，與第7管相同，只是在加入0.2ml蔗糖之前，先加入堿性銅試劑，防止酶解作用。此管只用于觀察，不進行計算。 6. 計算柱級分IV的酶活力： Units / ml原始溶液。 7. 以每分鐘生成的還原糖的moles數(shù)為縱座標，以試管中1ml反應(yīng)混合物中的酶濃度（mg蛋白/ml）為橫座標，畫出反應(yīng)速度與酶濃度的關(guān)系曲線。 表 1 級分、的酶活力測定 各管名稱對照 粗級分 熱級

8、分 醇級分葡萄糖 管數(shù) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12 酶液(ml) 0.0 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 / /H2O(ml) 0.6 0.55 0.40 0.10 0.05 0.20 0.10 0.55 0.40 0.10 1.0 0.8乙酸緩沖液 (0.2mol/L pH4.9) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / /葡萄糖2mmol/L / / / / / / / / / / / 0.2蔗糖0.2mol/L 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.

9、2 0.2 0.2 0.2 / / 加入蔗糖，立即搖勻開始計時，室溫準確反應(yīng)10min后，立即加堿性銅試劑中止反應(yīng)。堿性銅試劑 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 用保鮮膜封口，扎眼，沸水浴加熱8min，立即用自來水冷卻。磷鉬酸試劑 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 H2O 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 A650nmE=mol/minml平均Emol/minmlUnits/ml原始組分稀釋后酶液的活力(按還原

10、糖計算)： 式中： A650 第210管所測A650 A650第12管所測A6500.2 第12管葡萄糖取樣量2 標準葡萄糖濃度2mmol/L = 2mol/ml 10 反應(yīng)10min B 每管加入酶液ml數(shù) 原始酶液的酶活力 E = (平均E/2)稀釋倍數(shù)（Units / ml原始組分）八、計算各級分的比活力，純化倍數(shù)及回收率，并將數(shù)據(jù)列于下表：為了測定和計算下面純化表中的各項數(shù)據(jù)，對各個級分都必須取樣，每取一次樣，對于下一級分來說會損失一部分量，因而要對下一個級分的體積進行校正，以使回收率的計算不致受到不利的影響。 酶的純化表如下：級分記錄體積(ml)校正體積(ml)蛋白質(zhì)(mg/ml)總蛋白(mg)Units/ml總Units比活Units/mg純化倍數(shù)回收率% 1.0100注：一個酶活力單位Units，是在給定的實驗條件下，每分鐘能催化1mole蔗糖水解所需的酶量，而水解1mole蔗糖則生成2moles還原糖，計算時請注意。 下面是對假定的