實(shí)驗(yàn)操作指導(dǎo)書：蔗糖酶各級(jí)分活性及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

1、（三）蔗糖酶各級(jí)分活性及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握蔗糖酶活性測(cè)定方法，了解各級(jí)分酶的純化情況。二、原理為了評(píng)價(jià)酶的純化步驟和方法，必須測(cè)定各級(jí)分酶活性和比活。測(cè)定蔗糖酶活性的方法有許多種，如費(fèi)林試劑法、Nelsons試劑法、水楊酸試劑法等，本實(shí)驗(yàn)先使用費(fèi)林試劑法，以后測(cè)米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax時(shí)再用Nelsons試劑法。費(fèi)林試劑法靈敏度較高，但數(shù)據(jù)波動(dòng)較大，因?yàn)榉磻?yīng)后溶液的顏色隨時(shí)間會(huì)有變化，因此加樣和測(cè)定光吸收值時(shí)最好能計(jì)時(shí)。其原理是在酸性條件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成一分子葡萄糖和一分子果糖。這些具有還原性的糖與堿性銅試劑混合加熱后被氧化，二價(jià)銅被還原成棕紅色氧化亞銅沉

2、淀，氧化亞銅與磷鉬酸作用，生成蘭色溶液，其蘭色深度與還原糖的量成正比，于650nm測(cè)定光吸收值。三、試劑 1. 堿性銅試劑（用畢回收） 稱10g無水NaCO3 ,加入100ml去離子水溶解，另稱1.88g酒石酸，用100ml去離子水溶解，混合二溶液，再加入1.13克結(jié)晶CuSO4，溶解后定容到250ml。 2. 磷鉬酸試劑（用畢回收） 在燒杯內(nèi)加入鉬酸17.5g，鎢酸鈉2.5g，10% NaOH 100ml, 去離子水100ml，混合后煮沸約30min（小心不要蒸干），驅(qū)去鉬酸中存在的氨，直到無氨味為止，冷卻后加85%磷酸63ml,混合并稀釋到250ml。 3. 0.25%苯甲酸200ml，配

3、葡萄糖用，防止時(shí)間長溶液長菌，也可以用去離子水代替。 4. 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液： （1）貯液：精確稱取無水葡萄糖（應(yīng)在105恒重過）0.1802克，以0.25%苯甲酸溶液溶解后，定容到100ml容量瓶中（濃度10mmol/L）。 （2）操作溶液：用移液管取貯液10ml，置于50ml容量瓶中，以用0.25%苯甲酸或去離子水稀釋至刻度（濃度為2mmol/L）。 5. 0.2mol/L蔗糖溶液50ml，分裝于小試管中冰凍保存，因蔗糖極易水解，用時(shí)取出一管化凍后搖勻。 6. 0.2mol/L乙酸緩沖液，pH4.9，200ml。 7. 牛血清清蛋白標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（濃度范圍：200500g/ml，精確配制50

4、ml）。 8. 考馬斯亮蘭G-250染料試劑，100mg考馬斯亮蘭G-250全溶于50ml 95%乙醇后，加入120ml 85%磷酸，用去離子水稀釋到1L（公用）。四、儀器 1. 試管20支，試管架1個(gè) 2. 秒表1塊，或用手表。 3. 移液管：0.1、0.2、2.0、5.0ml 4. 塑料可見比色杯（杯上和器皿染色后可用少量95% 的乙醇蕩洗） 5. 水浴鍋 6. 電爐 7. 保鮮膜 8. 橡皮筋五、各級(jí)分蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 采用考馬斯亮蘭染料法（Bradford法）的微量法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，參見 實(shí)驗(yàn)“蛋白質(zhì)含量的測(cè)定法”（因Tris會(huì)干擾Lowry法的測(cè)定）。標(biāo)準(zhǔn)蛋白的取樣量為0.1、0.2

5、、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0ml，用去離子水補(bǔ)足到1.0ml。各級(jí)分先要仔細(xì)尋找和試測(cè)出合適的稀釋倍數(shù)，并詳細(xì)記錄稀釋倍數(shù)的計(jì)算（使用移液管和量筒稀釋）。下列稀釋倍數(shù)僅供參考： 粗級(jí)分 I： 1050倍 熱級(jí)分II： 1050倍 醇級(jí)分III： 1050倍 柱級(jí)分IV： 不稀釋 確定了稀釋倍數(shù)后，每個(gè)級(jí)分取3個(gè)不同體積的樣進(jìn)行測(cè)定，然后取平均值，計(jì)算出各級(jí)分蛋白質(zhì)濃度。六、級(jí)分I、II、III蔗糖酶活性測(cè)定 用0.02mol/L pH4.9乙酸緩沖液（也可以用pH56的去離子水代替）稀釋各級(jí)分酶液，試測(cè)出測(cè)酶活合適的稀釋倍數(shù)： I ： 100010000倍 II ： 100

6、010000倍 III ： 100010000倍 以上稀釋倍數(shù)僅供參考。 按“表1”的順序在試管中加入各試劑，進(jìn)行測(cè)定，為簡化操作可取消保鮮膜封口，沸水浴加熱改為用9095水浴加熱810min。七、柱級(jí)分IV酶活力的測(cè)定 1. 酶活力的測(cè)定參照“表1”設(shè)計(jì)一個(gè)表格，反應(yīng)混合物仍為1ml。 2. 第1管仍為蔗糖對(duì)照，9、10管為葡萄糖的空白與標(biāo)準(zhǔn)，與“表1”中的11、12管相同。 3. 27管加入柱級(jí)分IV（取樣前先試測(cè)出合適的稀釋倍數(shù)），分別為0.02 ml、0.05 ml、0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml和0.6ml，然后各加0.2ml乙酸緩沖液（0.2mol/L pH4.9），每管

7、用去離子水補(bǔ)充到0.8ml。 4. 17管各加入0.2 ml 0.2mol/L的蔗糖，每管由加入蔗糖開始計(jì)時(shí)，室溫下準(zhǔn)確反應(yīng)10min，立即加入1ml堿性銅試劑中止反應(yīng)，然后按“表1”中的步驟進(jìn)行測(cè)定。 5. 第8管為0時(shí)間對(duì)照，與第7管相同，只是在加入0.2ml蔗糖之前，先加入堿性銅試劑，防止酶解作用。此管只用于觀察，不進(jìn)行計(jì)算。 6. 計(jì)算柱級(jí)分IV的酶活力： Units / ml原始溶液。 7. 以每分鐘生成的還原糖的moles數(shù)為縱座標(biāo)，以試管中1ml反應(yīng)混合物中的酶濃度（mg蛋白/ml）為橫座標(biāo)，畫出反應(yīng)速度與酶濃度的關(guān)系曲線。 表 1 級(jí)分、的酶活力測(cè)定 各管名稱對(duì)照 粗級(jí)分 熱級(jí)

8、分 醇級(jí)分葡萄糖 管數(shù) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12 酶液(ml) 0.0 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 / /H2O(ml) 0.6 0.55 0.40 0.10 0.05 0.20 0.10 0.55 0.40 0.10 1.0 0.8乙酸緩沖液 (0.2mol/L pH4.9) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / /葡萄糖2mmol/L / / / / / / / / / / / 0.2蔗糖0.2mol/L 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.

9、2 0.2 0.2 0.2 / / 加入蔗糖，立即搖勻開始計(jì)時(shí)，室溫準(zhǔn)確反應(yīng)10min后，立即加堿性銅試劑中止反應(yīng)。堿性銅試劑 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 用保鮮膜封口，扎眼，沸水浴加熱8min，立即用自來水冷卻。磷鉬酸試劑 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 H2O 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 A650nmE=mol/minml平均Emol/minmlUnits/ml原始組分稀釋后酶液的活力(按還原

10、糖計(jì)算)： 式中： A650 第210管所測(cè)A650 A650第12管所測(cè)A6500.2 第12管葡萄糖取樣量2 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度2mmol/L = 2mol/ml 10 反應(yīng)10min B 每管加入酶液ml數(shù) 原始酶液的酶活力 E = (平均E/2)稀釋倍數(shù)（Units / ml原始組分）八、計(jì)算各級(jí)分的比活力，純化倍數(shù)及回收率，并將數(shù)據(jù)列于下表：為了測(cè)定和計(jì)算下面純化表中的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，對(duì)各個(gè)級(jí)分都必須取樣，每取一次樣，對(duì)于下一級(jí)分來說會(huì)損失一部分量，因而要對(duì)下一個(gè)級(jí)分的體積進(jìn)行校正，以使回收率的計(jì)算不致受到不利的影響。 酶的純化表如下：級(jí)分記錄體積(ml)校正體積(ml)蛋白質(zhì)(mg/ml)總蛋白(mg)Units/ml總Units比活Units/mg純化倍數(shù)回收率% 1.0100注：一個(gè)酶活力單位Units，是在給定的實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘能催化1mole蔗糖水解所需的酶量，而水解1mole蔗糖則生成2moles還原糖，計(jì)算時(shí)請(qǐng)注意。 下面是對(duì)假定的