核酸雜交技術(shù)全解

1、核酸雜交技術(shù)全解核酸雜交技術(shù)全解第1頁目 錄第一節(jié) 核酸分子雜交概念一、核酸探針二、分子雜交信號(hào)檢測(cè)第二節(jié) 經(jīng)典核酸分子雜交技術(shù)一、固相雜交二、液相雜交核酸雜交技術(shù)全解第2頁目 錄第四節(jié) 影響雜交信號(hào)檢測(cè)原因一、探針選擇二、探針標(biāo)識(shí)方法三、探針濃度四、雜交率五、雜交溫度六、雜交嚴(yán)格謹(jǐn)性七、雜交反應(yīng)時(shí)間八、雜交促進(jìn)劑核酸雜交技術(shù)全解第3頁核酸分子雜交(molecular hybridization of nucleic acid)核酸分子雜交：?jiǎn)捂満怂岱肿釉谶m當(dāng)條件下，與含有堿基互補(bǔ)序列異源核酸形成雙鏈雜交體過程。核酸分子雜交技術(shù)：利用核酸分子雜交檢測(cè)靶序列一類技術(shù)稱核酸分子雜交技術(shù)。核酸分子雜

2、交技術(shù)當(dāng)前應(yīng)用廣泛，是定性或定量檢測(cè)特異RNA或DNA序列片段有力工具。核酸雜交技術(shù)全解第4頁第一節(jié) 核酸分子雜交概念變性 退火 復(fù)性核酸雜交技術(shù)全解第5頁核酸分子雜交基礎(chǔ)原理1、變性（denaturation）定義：在一定條件下，雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成無規(guī)則線團(tuán)，雙鏈解鏈成為單鏈。 核酸雜交技術(shù)全解第6頁2、融解溫度 (Melting Temperature, Tm)定義：在DNA熱變性時(shí)，其A260升高達(dá)最大值二分之一時(shí)溫度。影響Tm原因： （1）DNA堿基組成 G-C含量越多 Tm值越高 A-T含量越多 Tm值越低 （2）溶液離子強(qiáng)度 低離子強(qiáng)度 Tm值越低 高離子強(qiáng)度 T

3、m值越高 （3）pH值 pH值5-9 Tm值改變不顯著 pH11 不利于氫鍵形成 （4）變性劑 干擾堿基堆積力和氫鍵形成核酸雜交技術(shù)全解第7頁3.復(fù)性 變性DNA經(jīng)過一定處理重新形成雙螺旋過程。影響復(fù)性速度原因： DNA濃度 DNA片段大小 DNA片段復(fù)雜性 適當(dāng)復(fù)性溫度 適當(dāng)離子強(qiáng)度核酸雜交技術(shù)全解第8頁重點(diǎn)提醒 分子雜交：指含有一定同源序列兩條核酸單鏈（DNA或RNA），在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對(duì)標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)過退火處理，形成異質(zhì)雙鏈過程。利用這一原理，就能夠使用已知序列單鏈核酸片段作為探針，去查找各種不一樣起源基因組DNA分子中同源基因或同源序列。核酸雜交技術(shù)全解第9頁一、核酸探針 核酸探針指能

4、與靶核酸序列發(fā)生堿基互補(bǔ)雜交，并能由其標(biāo)識(shí)被特異性檢測(cè)核酸分子。核酸雜交技術(shù)全解第10頁探針種類寡核苷酸探針基因組DNA探針cDNA探針RNA探針DNA探針（一）常見探針種類核酸雜交技術(shù)全解第11頁1. DNA探針 最常見核酸探針三大優(yōu)點(diǎn)： 這類探針大多克隆在質(zhì)粒載體中，能夠無限繁殖，制備方法簡(jiǎn)便； DNA探針相對(duì)不易被降解，普通DNA酶活性能有效地被抑制； DNA探針標(biāo)識(shí)方法較成熟，有各種方法可供選擇，如缺口平移法、隨機(jī)引物法、PCR標(biāo)識(shí)法等，能用于放射性核素和非放射性物質(zhì)標(biāo)識(shí)。 核酸雜交技術(shù)全解第12頁2.RNA探針優(yōu)點(diǎn)：雜交效率高，穩(wěn)定性高，非特異性雜交較少，未雜交探針可用RNase 降

5、解，降低本底干擾。 缺點(diǎn)：易降解，標(biāo)識(shí)方法復(fù)雜 。核酸雜交技術(shù)全解第13頁3.寡核苷酸探針寡核苷酸探針普通由1750個(gè)核苷酸組成。優(yōu)勢(shì)：能夠區(qū)分僅僅一個(gè)堿基差異靶序列；缺點(diǎn)：寡核苷酸不如長雜化核酸分子穩(wěn)定，需優(yōu)化雜交和洗脫條件以確保寡核苷酸探針雜交特異性。核酸雜交技術(shù)全解第14頁（二）探針長度1.DNA和RNA探針 DNA探針通常為400500個(gè)堿基2. 寡核苷酸探針 探針最小長度取決于其靶序列復(fù)雜性核酸雜交技術(shù)全解第15頁（三）核酸探針標(biāo)識(shí) 1. 探針標(biāo)識(shí)物選擇（1）放射性標(biāo)識(shí)（2）非放射性標(biāo)識(shí)依據(jù)標(biāo)識(shí)物摻入情況可分為均勻標(biāo)識(shí)和末端標(biāo)識(shí)探針。核酸雜交技術(shù)全解第16頁不一樣標(biāo)識(shí)類型探針比較：

6、優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)放射性探針能夠準(zhǔn)確定量；靈敏度高；本底低；易于除去舊探針,重新雜交新探針短半衰期探針需臨用前制備；放射性遞減使探針降解；放射性物質(zhì)對(duì)人體有害；費(fèi)用貴非放射性探針對(duì)人體危害??；穩(wěn)定，可供長時(shí)間內(nèi)連續(xù)使用；檢測(cè)過程快；可同時(shí)進(jìn)行不一樣標(biāo)識(shí)探針雜交；本底較低靈敏度不如放射性探針；雜交條件受匯報(bào)基團(tuán)限制；重新雜交新探針比較困難核酸雜交技術(shù)全解第17頁2.探針標(biāo)識(shí)方法選擇 制備探針步驟：探針標(biāo)識(shí)去除未標(biāo)識(shí)核酸探針檢測(cè)探針標(biāo)識(shí)效率 核酸探針標(biāo)識(shí)方法(1) DNA切口平移標(biāo)識(shí)法(2) DNA隨機(jī)引物標(biāo)識(shí)法(3) DNA末端標(biāo)識(shí)(7) RNA探針標(biāo)識(shí)(4) cDNA探針標(biāo)識(shí)(5) 寡核苷酸探針標(biāo)識(shí)(6

7、) 單鏈DNA探針標(biāo)識(shí)核酸雜交技術(shù)全解第18頁隨機(jī)引物：含有各種可能排列次序寡核苷酸片段混合物。DNA聚合酶Klenow片段：保留53DNA聚合酶活性,弱35外切酶活性，無53外切酶活性。（1）DNA隨機(jī)引物標(biāo)識(shí)核酸雜交技術(shù)全解第19頁5 3 3 5 32P-個(gè)別標(biāo)識(shí)單鏈DNA片段切口原始位置切口最終位置32P-標(biāo)識(shí)DNADNA聚合酶I-32P-dCTP變性DNase I，Mg2+dATP，dGTP，dTTPDNA酶：在雙鏈DNA上隨機(jī)打開若干個(gè)單鏈缺口，產(chǎn)生3-OH端。大腸桿菌DNA聚合酶：53DNA聚合酶活性；53 外切核酸酶活性。（2）DNA切口平移標(biāo)識(shí)核酸雜交技術(shù)全解第20頁 條件是有

8、5-OH存在，人工合成寡核苷酸最常見；雙鏈DNA需用堿性磷酸酶切除5-P后再標(biāo)識(shí)5p-HO-CpGpTpA35HO-CpGpTpA3T4噬菌體多核苷酸激酶-32P-ATP532p-O-CpGpTpA337，反應(yīng)10min, -32P-ATP 需150 ci/反應(yīng)1) DNA5末端標(biāo)識(shí)堿性磷酸酶(3) DNA末端標(biāo)識(shí)核酸雜交技術(shù)全解第21頁5335完整雙鏈DNA限制性內(nèi)切酶5335-32P-dNTP其它3 種dNTPKlenow DNA聚合酶5335變性53355末端突出DNA3末端標(biāo)識(shí)DNA32P-末端標(biāo)識(shí)單鏈DNA探針2) DNA3末端標(biāo)識(shí)核酸雜交技術(shù)全解第22頁二、分子雜交信號(hào)檢測(cè)（一）放

9、射性標(biāo)識(shí)探針檢測(cè)1、放射自顯影2、液體閃爍計(jì)數(shù)法（二）非放射性標(biāo)識(shí)探針雜交檢測(cè)1、酶促顯色檢測(cè)2、熒光檢測(cè)3、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)4、多探針檢測(cè)核酸雜交技術(shù)全解第23頁（一）放射性標(biāo)識(shí)探針檢測(cè)1.放射自顯影 放射性雜交檢測(cè)基于放射性核素釋放能量將照片紙感光原理。用32P標(biāo)識(shí)雜交最常見檢測(cè)方法是放射自顯影。核酸雜交技術(shù)全解第24頁2.液體閃爍計(jì)數(shù)法 液體閃爍計(jì)數(shù)法工作原理是被測(cè)樣品輻射發(fā)出輻射能經(jīng)溶劑分子傳遞給閃爍劑分子，當(dāng)被激發(fā)閃爍劑分子從激發(fā)態(tài)退激為穩(wěn)態(tài)時(shí)，以熒光光子形式輻射能量，經(jīng)光電倍增管放大并被測(cè)量，就能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)放射性核素測(cè)定。核酸雜交技術(shù)全解第25頁（二）非放射性標(biāo)識(shí)探針雜交檢測(cè) 1.酶促顯

10、色檢測(cè)（1）直接檢測(cè)酶本身作為標(biāo)識(shí)分子摻入到核酸中去，在洗脫后就可直接進(jìn)行檢測(cè)。酶直接作用于顯色底物，產(chǎn)生顏色沉淀，顯色沉淀可用肉眼檢測(cè)。酶直接作用于化學(xué)發(fā)光底物發(fā)光, 發(fā)光檢測(cè)要依賴于對(duì)藍(lán)光敏感X膠片。這種檢測(cè)法常見于寡核苷酸探針雜交，這類雜交反應(yīng)溫度低。 核酸雜交技術(shù)全解第26頁堿性磷酸酶顯色反應(yīng)示意圖核酸雜交技術(shù)全解第27頁HRP酶顯色反應(yīng)示意圖(DAB)(TMB)核酸雜交技術(shù)全解第28頁Dig：半抗原，可經(jīng)過抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)與顯色體系偶聯(lián)Dig-DNA探針 + 抗Dig抗體-堿性磷酸酶（或辣根過氧化物酶）+ 底物（2）間接檢測(cè) 檢測(cè)含地高辛、熒光素或生物素標(biāo)識(shí)探針時(shí)，就要增加一個(gè)將酶連

11、接到雜化核酸分子上步驟。核酸雜交技術(shù)全解第29頁 熒光素：一類能在激發(fā)光作用下發(fā)射出熒光物質(zhì) 熒光顯微鏡觀察、免疫組織化學(xué)法 2熒光檢測(cè) 核酸雜交技術(shù)全解第30頁化學(xué)發(fā)光是指化學(xué)反應(yīng)中釋放能量以光形式發(fā)射出來形成檢測(cè)信號(hào)。化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)中當(dāng)前常見酶有堿性磷酸酶及辣根過氧化物酶發(fā)射光線強(qiáng)度反應(yīng)了酶活性，反應(yīng)了雜化分子量。 3化學(xué)發(fā)光底物 辣根過氧化物酶催化化學(xué)發(fā)光反應(yīng)核酸雜交技術(shù)全解第31頁采取發(fā)色體檢測(cè)最大益處是可同時(shí)檢測(cè)一個(gè)以上雜化分子每種探針分別用不一樣匯報(bào)基團(tuán)如生物素、熒光素和地高辛標(biāo)識(shí)并同時(shí)與固定在濾膜上核酸雜交采取不一樣鏈霉抗生素或抗體-酶和對(duì)應(yīng)底物組合4多探針檢測(cè) 核酸雜交技術(shù)

12、全解第32頁 第二節(jié) 經(jīng)典核酸分子雜交技術(shù)核酸雜交技術(shù)全解第33頁核酸分子雜交分類依據(jù)雜交核酸分子種類 DNA與DNA雜交 DNA與RNA雜交 RNA與RNA雜交依據(jù)雜交探針標(biāo)識(shí) 同位素雜交 非同位素雜交依據(jù)雜交介質(zhì) 液相雜交 固相雜交 原位雜交菌落雜交Southern印跡雜交Northern印跡雜交點(diǎn)雜交狹縫雜交核酸雜交技術(shù)全解第34頁分子雜交技術(shù)普通過程 探針制備及標(biāo)識(shí)（同位素或非同位素） 待測(cè)核酸樣品制備（分離，純化） 雜交（液相，固相，原位雜交） 雜交后處理（去掉非特異雜交分子） 顯示結(jié)果（顯色，發(fā)光，放射自顯影） 結(jié)果分析核酸雜交技術(shù)全解第35頁固相雜交：先將待測(cè)單鏈核酸樣品結(jié)合到固

13、相支持物（常見有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、化學(xué)活化膜等）上，然后與溶液中已知序列標(biāo)識(shí)探針進(jìn)行雜交，放射自顯影分析雜交結(jié)果。核酸雜交技術(shù)全解第36頁（一）反向點(diǎn)雜交反向點(diǎn)雜交（reverse dot blot, RDB）是將各種探針固定在同一膜上，同時(shí)參加檢測(cè)樣品DNA又互不干擾， 故能一次性篩查出各種不一樣序列。特點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快捷、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好較Northern blot省去了電泳和毛細(xì)轉(zhuǎn)膜過程核酸雜交技術(shù)全解第37頁（二）Southern印跡雜交 Southern印跡雜交（Southern blot hybridization/ Southern blotting）是指DNA與DNA分子之

14、間雜交。可用于基因組DNA定性與定量分析，重組質(zhì)粒和噬菌體分析等。核酸雜交技術(shù)全解第38頁（二）Southern印跡雜交包含兩個(gè)主要過程：將待測(cè)定核酸分子經(jīng)過一定方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，即印跡（blotting）。固定于膜上核酸與同位素標(biāo)識(shí)探針在一定溫度和離子強(qiáng)度下退火，即分子雜交過程。核酸雜交技術(shù)全解第39頁Southern印跡雜交基礎(chǔ)步驟： 待測(cè)DNA樣品限制性內(nèi)切酶消化 酶切DNA樣品電泳分離 凝膠中DNA變性和Southern轉(zhuǎn)移 探針制備 Southern雜交 雜交結(jié)果檢測(cè)核酸雜交技術(shù)全解第40頁限制性內(nèi)切酶消化酶切DNA樣品電泳分離凝膠中DNANa

15、OH變性凝膠中DNA分離帶Southern印跡凝膠中DNA帶被轉(zhuǎn)移到NC膜上標(biāo)識(shí)探針雜交探針雜交帶曝光顯影核酸雜交技術(shù)全解第41頁Southern雜交應(yīng)用 應(yīng)用單基因遺傳病基因診療基因點(diǎn)突變檢測(cè)臨床應(yīng)用用于以下疾病產(chǎn)前診療 鐮型細(xì)胞貧血 苯丙酮酸尿癥 珠蛋白合成障礙性貧血 假肥大型肌營養(yǎng)不良 血友病 慢性進(jìn)行型舞蹈病核酸雜交技術(shù)全解第42頁（三）Northern印跡雜交Northern 印跡（Northern blot）雜交是應(yīng)用DNA探針檢測(cè)特異mRNA另一個(gè)膜上印跡技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)原理和過程與Southern印跡基礎(chǔ)相同，只是檢測(cè)分子是RNA，可用來對(duì)組織或細(xì)胞中mRNA進(jìn)行定性或定量分析。

16、核酸雜交技術(shù)全解第43頁Northern雜交應(yīng)用 1. RNA病毒檢測(cè)2. 基因表示檢測(cè)Northern印跡技術(shù)被認(rèn)為是檢測(cè)基因表示水平金標(biāo)準(zhǔn)。 核酸雜交技術(shù)全解第44頁二、液相雜交 液相雜交是指待測(cè)核酸和探針都存在于雜交液中，探針與待測(cè)核酸在液體環(huán)境中按照堿基互補(bǔ)配對(duì)形成雜交分子過程。核酸雜交技術(shù)全解第45頁液相雜交 一個(gè)研究最早且操作簡(jiǎn)便雜交類型。 原理和反應(yīng)條件與固相雜交基礎(chǔ)相同，僅是將待檢測(cè)核酸樣品和雜交探針同時(shí)溶于雜交液中進(jìn)行反應(yīng)。 液相雜交后過量未雜交探針在溶液中除去較困難，同源與異源DNA分子在雜交過程中會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，使得雜交結(jié)果分析十分困難。 所以液相雜交應(yīng)用較少核酸雜交技術(shù)全解

17、第46頁三、原位雜交 應(yīng)用核酸探針與組織或細(xì)胞中核酸按堿基配對(duì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行特異性結(jié)合形成雜交體，然后應(yīng)用組織細(xì)胞化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位或基因表示檢測(cè)技術(shù)。 核酸雜交技術(shù)全解第47頁（一）基礎(chǔ)操作步驟： 雜交前準(zhǔn)備：保持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、保留核酸、增加組織通透性、減低背景。雜交：使探針與細(xì)胞中把序列結(jié)合。雜交后處理：鹽溶液漂洗，以降低背景。顯示：依據(jù)核酸探針標(biāo)志物種類選擇對(duì)應(yīng)檢測(cè)系統(tǒng)。 核酸雜交技術(shù)全解第48頁 （二）原位雜交應(yīng)用1. 細(xì)胞遺傳學(xué)分析產(chǎn)前診療生殖醫(yī)學(xué)中應(yīng)用血液疾病中染色體易位檢測(cè)實(shí)體瘤研究2. 比較基因組雜交3. 基因圖譜繪制4. 病原學(xué)檢測(cè)核酸雜交技術(shù)全解第49

18、頁熒光原位雜交(FISH, Fluorescence in situ Hybridization)利用熒光標(biāo)識(shí)探針與待測(cè)標(biāo)本核酸進(jìn)行原位雜交，在熒光顯微鏡下對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行區(qū)分和計(jì)數(shù)，從而對(duì)染色體或基因異常細(xì)胞、組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)和診療 核酸雜交技術(shù)全解第50頁核酸分子雜交技術(shù)類型 雜交類型檢測(cè)目標(biāo)及范圍Southern印跡雜交檢測(cè)經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上DNA分子Northern印跡雜交檢測(cè)經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上RNA分子反向斑點(diǎn)雜交檢測(cè)樣品中DNA或RNA分子原位雜交檢測(cè)細(xì)胞或組織上DNA或RNA分子核酸雜交技術(shù)全解第51頁 第四節(jié) 影響雜交信號(hào)檢測(cè)原因核酸雜交技術(shù)全解第52頁 在核酸雜

19、交反應(yīng)中影響雜交體形成原因較多，主要有探針選擇、探針標(biāo)識(shí)方法、探針濃度、雜交率、雜交最適溫度、雜交嚴(yán)謹(jǐn)性、雜交反應(yīng)時(shí)間及雜交促進(jìn)劑等。核酸雜交技術(shù)全解第53頁一、探針選擇在大多數(shù)情況下，能夠選擇克隆DNA或cDNA雙鏈探針。不過在有些情況下，必須選取其它類型探針如寡核苷酸探針和RNA探針。核酸雜交技術(shù)全解第54頁二、探針標(biāo)識(shí)方法探針標(biāo)識(shí)方法很多，選擇什么標(biāo)識(shí)方法主要視個(gè)人習(xí)慣和可利用條件而定。但在選擇標(biāo)識(shí)方法時(shí)，還應(yīng)考慮試驗(yàn)要求，如靈敏度和顯示方法等。普通認(rèn)為放射性探針比非放射性探針靈敏度高。核酸雜交技術(shù)全解第55頁三、探針濃度隨探針濃度增加，雜交率也增加。在較窄范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。探針濃度過低會(huì)降低雜交靈敏度，過高又會(huì)增加背景染色。普通認(rèn)為，最正確標(biāo)準(zhǔn)是應(yīng)用與靶核苷酸探針