原卟啉鈉體內(nèi)外抗乙肝病毒作用研究

1、原卟啉鈉體內(nèi)外抗乙肝病毒作用研究【摘要】目的觀察原卟啉鈉體內(nèi)外抗乙肝病毒作用。方法體內(nèi)實驗采用先天感染鴨乙肝模型，檢測給藥前、給藥后5d、10天及停藥后3d鴨血清DHBV-DNA的動態(tài)變化；體外實驗采用2.2.15細胞為模型，檢測用藥后對細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的抑制作用。結(jié)果體內(nèi)實驗顯示，給藥第5，10d時鴨血清DHBV-DNA其D值均明顯低于給藥前，差異有顯著性意義(P0.05)；體外實驗顯示，原卟啉鈉在所稀釋的各濃度下，對細胞分泌HBsAg，HBeAg均有一定的抑制作用，對HBsAg，HBeAg的治療指數(shù)分別大于188.7和64.5。結(jié)論原卟啉鈉體內(nèi)外均具有明顯的抗乙肝病毒

2、作用。【關(guān)鍵詞】原卟啉鈉鴨乙型肝炎病毒2.2.15細胞株Abstrat:bjetiveTbservetheinhibitryeffetfNAPPnHepatitisBvirusinvitrandinviv.ethdsDukdelfngenitalinfetinfHBVasusedintheinvivtest.DHBV-DNAinseruasdetetedbydt-hybridizatintestbefretreatent,5daysand10daysaftertreatent.Theell2.2.15lineastakenaselldel.TheinhibitryeffetfNAPPnHBsA

3、gandHBeAgseretedby2.2.15ellsasevaluatedithELISAethd.ResultsIntheanialdel,theptidensityvaluefDHBV-DNAindukseruasreduedarkedlyaftertreatentithNAPPfr5daysand10days,thereasrearkabledifferene(P0.05).Intheelldel,NAPPhadbviusinhibitryeffetnHBsAgandHBeAgindifferentnentratins.ThetherapeutiindexfNAPPasgreater

4、than188.7frHBsAgand64.5frHBeAg.nlusinNAPPhasaertaininhibitryeffetnHepatitisBvirusinvitrandinviv.Keyrds:Prtprphyrindisdiu(NAPPP)；DukhepatitisvirusB；2.2.15ellulture抗病毒治療目前是治療乙型病毒性肝炎的關(guān)鍵，而現(xiàn)有的抗病毒藥物多數(shù)具有治療后長期應答率不夠理想以及較多的副作用等問題，所以尋找新的、高效低毒抗乙肝病毒藥物就顯得尤為重要，原卟啉鈉分子式34H32N44Na2，化學名為1，3，5，8-四甲基-2，4二乙烯基卟吩-6，7-二丙酸鈉(

5、PrtprphyrinDisdiuNAPP)，是由四個吡咯環(huán)經(jīng)四個次甲基鍵連接而成的含共扼雙鍵的大環(huán)化合物，可由血紅蛋白的輔基血紅素經(jīng)人工提娶加工而成的。近年來有研究報道，NAPP體外具有抗乙型肝炎病毒HepatitisBvirus,HBV的作用1。為了進一步明確其抗病毒效果，本研究對NAPP體內(nèi)外抗HBV作用進展了實驗研究?，F(xiàn)報道如下。1材料1.1藥物原卟啉鈉NAPP，本實驗室提取，純度94.1%；拉米夫定葛蘭素史抑制藥蘇州消費，批準文號：國藥準字H20220581。1.2動物1日齡龍巖麻鴨35只，雄性，體重505g，購自石井潮陽村孵化場，常規(guī)飼養(yǎng)。飼料：寶鼎501小鴨飼料，由穗屏企業(yè)飼料廠

6、消費。1.3試劑缺口翻譯平移試劑盒購自美國Prega公司；-32P-dTP購自北京市亞輝生物醫(yī)學工程公司；N膜購自Aersha公司；DHBV質(zhì)粒由廣州中醫(yī)藥大學熱帶病研究所病毒室保存；SephadexG-50購自Pharaia公司；E干粉、胎牛血清購自GIB公司；HBsAg，HBeAg抗原檢測試劑盒購自上?？迫A生物工程公司；TT檢測試劑盒購自北京碧云天公司；PR試劑盒購自華美生物工程公司。1.4HepG2.2.15細胞引自上海復旦大學醫(yī)學院分子病毒實驗室。2方法2.1體內(nèi)實驗2.1.1動物的分組及給藥方法1日齡龍巖麻鴨購回后喂養(yǎng)2d后，自脛靜脈取血，離心，搜集血清，用斑點雜交的方法檢測DHBV

7、-DNA，第13天出結(jié)果，挑選出先天自然感染鴨后進展下一步實驗。將DHBV-DNA陽性鴨隨機分為3組：模型組、拉米夫定組和NAPP組，每組8只。NAPP組和拉米夫定組每天按20g/kgd劑量口服給藥，模型組以生理鹽水代替藥物，連續(xù)給藥10d。分別于給藥前、給藥后5d、給藥后10d及停藥后第3天采集血樣，別離血清，-70凍存待檢。2.1.2鴨血清DHBV-DNA的檢測采用DHBV-DNADtBlt法測定2。取上述鴨血清，每批同時點膜，測定鴨血清中DHBV-DNA程度，觀察其動態(tài)變化。按缺口翻譯試劑盒說明書方法，用32P標記DHBV-DNA探針，將40l血清點于硝酸纖維膜上，然后雜交，放射自顯影，

8、在酶標檢測儀上測定D值濾光片波長為490n。2.2體外實驗2.2.1細胞毒性檢測根據(jù)sann等建立的四甲基偶氮唑鹽微量酶反響比色法TT法檢測藥物細胞毒性。詳細方法：用胰酶消化HepG2.2.15細胞后，調(diào)整細胞濃度至2104ell/l，參加96孔培養(yǎng)板中，每孔100l，每個濃度設3孔，培養(yǎng)24d，吸去上清后參加含有不同濃度藥物1，10-1，10-2，10-3，10-4g/l的DE培養(yǎng)基。作用72d之后，各孔中參加10l的TT并繼續(xù)培養(yǎng)4h，去上清，每孔參加100lDS，輕輕振蕩使甲臜溶解，測570n波長下吸光度的D值。計算細胞存活率和各種藥物的半數(shù)毒性濃度T50，T50是實驗組存活細胞為對照組

9、的50%時的藥物濃度。細胞存活率%=D實驗孔D空白對照D細胞對照D空白對照100%，T50=AntilgB+(50-50%破壞百分率)/50%破壞百分率-50%破壞百分率=A-B，A=lg50%藥物濃度B=lg50%藥物濃度2.2.2藥物對細胞分泌的HBsAg、HBeAg抑制作用HepG2.2.15細胞胰酶消化后，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1l，培養(yǎng)4d后換用含藥培養(yǎng)液，并設拉米夫定為陽性對照組。根據(jù)藥物毒性實驗結(jié)果，確定藥物的濃度，每濃度加3孔，同時設不加藥細胞對照3孔及培養(yǎng)液空白對照3孔，并于第3，6天更換新穎的含藥液培養(yǎng)，第9天搜集各孔細胞上清液，-20冷凍。采用ELISA法檢測上清液中H

10、BsAg，HBeAg。藥物對抗原的抑制百分率%=D細胞對照D實驗孔D細胞對照D空白對照100%，I50為HBsAg，HBeAg抑制率為50%時的藥物濃度。治療指數(shù)TI=T50/I50。2.3統(tǒng)計學處理F分析配對t檢驗采用SPSS11.5軟件包進展統(tǒng)計分析。3結(jié)果3.1體內(nèi)實驗各實驗組用藥后不同時間光密度值與同組給藥前光密度值的比擬。見表1。NAPP組在給藥后第5天鴨血清DHBV-DNA程度有較明顯下降，與給藥前自身比擬，差異有顯著性(P0.05)，第10天與給藥前自身比擬，差異有顯著性意義(P0.01)。拉米夫定組在給藥后第5天DHBV-DNA程度明顯下降，與給藥前自身比擬，差異有顯著性意義(

11、P0.01)。表1NAPP對鴨乙肝模型血清病毒滴度的抑制作用(略)3.2體外實驗NAPP對HepG2.2.15細胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用見表23。由表2可知，NAPP和拉米夫定的各濃度組與細胞對照組相比HBsAg，HBeAg的D值差異均有顯著性P0.05。NAPP的各劑量組之間HBsAg，HBeAg的D值差異有顯著性P0.05。NAPP組各濃度與拉米夫定組各濃度相比，對HBsAg，HBeAg抑制差異無顯著性P0.05。表2藥物對HepG2.2.15細胞分泌HBsAg，HBeAg的抑制作用(略)表3NAPP和拉米夫定對HBsAg，HBeAg的治療指數(shù)藥物T50(略)用TI來評價NA

12、PP的抗HBV效果。當TI2時，受試藥物高效低毒，TI越大，那么說明該藥對HBV的抑制作用越強，細胞毒越小3。由表3可知，NAPP對HBsAg，HBeAg的治療指數(shù)分別大于188.7和64.5，提示對HBsAg，HBeAg的分泌均有抑制作用且毒性低。4討論由于鴨乙肝病毒生物學特性及感染特點與人乙型肝炎病毒類似，已被作為研究人乙型肝炎病毒的重要動物模型4，所以本實驗采用先天感染的鴨乙肝模型，研究NAPP體內(nèi)抗乙肝病毒的作用。實驗結(jié)果顯示，陽性藥物拉米夫定按20g/kgd劑量，連續(xù)灌胃10d，可顯著抑制DHBV-DNA，停藥3dDHBV-DNA顯著上升，與臨床結(jié)果相吻合，說明本次實驗是成功的。受試

13、藥物原卟啉鈉10d療程中，各時點DHBV-DNA變化差異也有顯著性意義(藥后5d，P0.05；藥后10d，P0.01)，停藥3dDHBV-DNA顯著上升，提示NAPP在鴨體內(nèi)對DHBV-DNA有明顯抑制作用。HBV-DNA轉(zhuǎn)染人類肝癌細胞株HepG2所建立HepG的2.2.15細胞株能有效表達HBV復制的全部標志，是體外評價HBV藥物的較好模型。本實驗結(jié)果說明，NAPP在所稀釋的各濃度下對HepG2.2.15細胞分泌HBsAg，HBeAg均有一定的抑制作用，且抑制作用與藥物濃度呈一定的劑量依賴關(guān)系。NAPP和拉米夫定的治療指數(shù)都遠遠大于2，提示NAPP和拉米夫定皆為高效低毒型藥物。本研究顯示NAPP在體內(nèi)外可有效抑制乙肝病毒的復制，其抑制病毒效果與拉米夫定相近，且毒副作用小，所以NAPP有望成為治療乙型病毒性肝炎的一種新藥，有進一步研究的價值?！緟⒖嘉墨I】1ha-PinLi,Li-FaXu,Hng-QunLiu,etal.ExtratinfprtprphyrindisdiuanditsinhibitryeffetsnHBV-DNAJ.rldJGastrenterl,2022,10(3)：433.2陳淵卿，顧健人，蔣惠秋，等.斑點