試劑盒原理專題知識講座

1、試劑盒原理專題知識講座試劑盒原理專題知識講座第1頁第一個別 抗原抗體基礎概念一、概念抗原（Antigen, Ag）是刺激機體產(chǎn)生免疫應（應是指抗原刺激機體產(chǎn)生免疫應答產(chǎn)物-抗體或免疫效應細胞）答（答是指對應抗原與免疫應答產(chǎn)物結合并將其排除體外）物質(zhì)。抗原主要指病原微生物及其代謝產(chǎn)物以及抗毒素血清和藥品等。依據(jù)起源可分為外來抗原和本身抗原。試劑盒原理專題知識講座第2頁 二、抗原兩種基礎特征1. 免疫原性（immunogenecity），是指抗原分子能夠刺激機體產(chǎn)生免疫應答（產(chǎn)生特異性抗體及免疫效應細胞）性質(zhì)。 AgTB致敏T細胞漿細胞抗體免疫原性示意圖試劑盒原理專題知識講座第3頁 2. 抗原性（

2、antigenicity），又稱免疫反應性，是指抗原分子與免疫應答產(chǎn)物（抗體或免疫效應細胞）發(fā)生特異性結合性質(zhì)。AgTB致敏T細胞漿細胞 抗原性（免疫反應性）示意圖抗體試劑盒原理專題知識講座第4頁 三、完全抗原與半抗原 1. 完全抗原（complete antigen)含有免疫原性和抗原性物質(zhì)。 2. 半抗原（incomplete antigen ）無免疫原性，只有抗原性物質(zhì)。 3. 載體（carrier）賦予半抗原以免疫原性蛋白質(zhì)。4. 半抗原 + 蛋白質(zhì)（載體） 完全抗原。 5. 抗原決定簇（antigenic determinant）, 又稱表位（epitope）?？乖肿哟嬖谀芘cTCR

3、/BCR或抗體Fab片段特異性結合特殊化學基團，是免疫應答特異性物質(zhì)基礎。 試劑盒原理專題知識講座第5頁四、 抗體概論1. 抗體（antibody, Ab） 是由抗原刺激而產(chǎn)生并能與刺激其產(chǎn)生抗原發(fā)生特異性結合、含有免疫功效糖蛋白?？贵w主要存在血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、小腸粘膜液、唾液以及乳汁等其它體液中。 2. 免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig） 含有抗體活性或化學結構與抗體分子相同球蛋白。試劑盒原理專題知識講座第6頁五、單克隆抗體和多克隆抗體1.多克隆抗體（polyclonal antibody） 抗原分子通常含有多個抗原決定簇，動物免疫后可刺激各種含有對應抗原受體B

4、細胞發(fā)生免疫應答，因而可產(chǎn)生各種針對不一樣抗原決定簇抗體。這些由不一樣B細胞克隆產(chǎn)生抗體稱為多克隆抗體（polycolonal antibody, PcAb）。 試劑盒原理專題知識講座第7頁2.單克隆抗體（monoclonal antibody, McAb）A.定義：由單一克隆B細胞雜交瘤產(chǎn)生、只識別抗原 分子某一特定抗原決定簇、含有高度特異性抗體。B.特點 含有高度均一性。C.雜交瘤細胞 骨髓瘤細胞 無限增殖； 免疫B細胞 合成、分泌特異性抗體。D.雜交瘤技術 HAT培養(yǎng)基：次黃嘌(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺 嘧啶核苷(T)。試劑盒原理專題知識講座第8頁單克隆抗體制備流程1.免疫動物（使小鼠

5、產(chǎn)生致敏B淋巴細胞）2.細胞融合（加入PEG）3.選擇性培養(yǎng)（HAT選擇性培養(yǎng)基）4.雜交瘤陽性克隆篩選與克隆化（ELISA方法進行篩選，特異性，親和力，效價及交叉反應評價）5.單克隆抗體大量制備（體內(nèi)誘生：腹水）（體外培養(yǎng)：細胞培養(yǎng)液）試劑盒原理專題知識講座第9頁單克隆抗體與多克隆抗體比較試劑盒原理專題知識講座第10頁酶標板已包被抗原或抗體試劑標準品、抗體、酶標物顯色液、終止液樣品處理液、洗滌液說明書第二個別 ELISA試劑盒組成及原理操作流程注意事項試劑盒原理專題知識講座第11頁 1 間接競爭法測抗原 樣本中待測藥品和固相化抗原共同競爭一定量抗體，加入酶標識抗抗體（酶標二抗）后能與固相化抗

6、原抗體復合物特異性結合，經(jīng)底物顯色后檢測，樣本中藥品含量愈高，競爭結合抗體量愈多，從而結合在固相上酶標識抗抗體（酶標二抗）量愈少，最終顯色也愈淺。本企業(yè)及我國產(chǎn)品多用此法。詳細操作步驟以下： 1）加入標準品/樣本，再加入抗體，保溫反應。樣本中藥品與固相抗原同時競爭與特異性抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去游離物質(zhì)及吸附在固相載體上結合不緊密物質(zhì)。2）加酶標抗抗體，固相免疫復合物中抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標識上酶。洗滌后，固相載體上酶量與樣本中受檢藥品量負相關。3）加底物顯色，固相上酶催化底物成為有色產(chǎn)物。經(jīng)過儀器檢測分析，測知樣本中抗原量。試劑盒原理專題知識講座第12頁 2

7、直接競爭法測抗原（1）直接競爭酶標抗原法測抗原樣本中待測藥品和一定量酶標抗原競爭與固相抗體結合，經(jīng)底物顯色后檢測，樣本中藥品含量愈高，結合在固相上酶標抗原量愈少，最終顯色也愈淺。（2）直接競爭酶標抗體法測抗原樣本中待測藥品和固相抗原競爭結合一定量酶標識抗體，經(jīng)底物顯色后檢測，樣本中藥品含量愈高，結合在固相上酶標抗體愈少，最終顯色也愈淺。直接競爭法詳細操作步驟以下： 1）加入標準品/樣本，再加入酶標抗體（或酶標抗原），保溫反應。樣本中藥品與固相抗原（或酶標抗原）同時競爭與特異性抗體（或固相抗體）結合，形成固相抗原-酶標抗體復合物（或抗體-酶標抗原復合物）。洗滌除去游離物質(zhì)及吸附在固相載體上結合不

8、緊密物質(zhì)。2）加底物顯色，固相上酶催化底物成為有色產(chǎn)物。經(jīng)過儀器檢測分析，測知樣本中抗原量。 國外大個別ELISA試劑盒均采取這類型。試劑盒原理專題知識講座第13頁 3雙抗體夾心法測抗原此法適合用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，比如乳鐵蛋白。只要取得針對受檢抗原異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。（曲線正相關）試劑盒原理專題知識講座第14頁第三個別 分析軟件使用及結果分析試劑盒原理專題知識講座第15頁試劑盒原理專題知識講座第16頁試劑盒原理專題知識講座第17頁試劑盒原理專題知識講座第18頁試劑盒原理專題知識講座第19頁試劑盒原理專題知識講座第20頁試劑盒原理專題知識講座第21

9、頁試劑盒原理專題知識講座第22頁試劑盒原理專題知識講座第23頁第四個別 ELISA試劑盒可能出現(xiàn)問題及處理方法試劑盒原理專題知識講座第24頁試劑盒原理專題知識講座第25頁第五個別 常見霉菌毒素及其危害、限量標準黃曲霉毒素（Alfatoxins）：包含B1、B2、G1、G2、M1、M2等17種，其中B1毒性最強。黃曲霉毒素中毒可降低畜禽對疾病抵抗力；玉米赤霉烯酮（Zearalenone）：雌激素樣作用，繁殖機能障礙；嘔吐毒素（Vomitoxin）：采食量下降、增重下降，皮膚炎癥；T-2毒素(T-2 Toxin)：口腔潰瘍，食欲不振，皮膚炎癥，消化道紊亂；伏馬毒素(Fumonisin)：神經(jīng)錯亂，

10、肝臟受損；赭曲霉毒素(Ochratoxins)：產(chǎn)生腎毒素，痛風癥。試劑盒原理專題知識講座第26頁 霉菌毒素殘留限量毒素樣品類型限量 (g/kg)黃曲霉毒素 B1玉米及玉米產(chǎn)品，花生及花生產(chǎn)品，花生油、玉米油20稻谷、大米、其它食用油10小麥、大麥及其加工制品，大豆及其發(fā)酵制品、調(diào)味品、堅果、其它谷物5嬰兒配方食品：大豆類、米類、米粉0.5黃曲霉毒素 M1乳及乳制品0.5嬰幼兒配方食品0.5GB 2761- 食品安全國家標準黃曲霉毒素限量標準試劑盒原理專題知識講座第27頁毒素樣品種類限量 (g/kg)黃曲霉毒素 B1玉米、花生餅（粕）、棉籽餅（粕）、菜籽餅（粕） 50肉牛精料補充料豆粕30生長

11、肥育豬、種豬配合料及濃縮料20肉用仔雞后期、生長雞、產(chǎn)蛋雞配合飼料及濃縮料鵪鶉配合飼料及濃縮料肉用仔鴨后期、生長鴨、產(chǎn)蛋鴨配合飼料及濃縮料15仔豬配合飼料及濃縮料10肉用仔雞前期、雛雞配合飼料及濃縮料肉用仔鴨前期、雛鴨配合飼料及濃縮料奶牛精補料10 霉菌毒素殘留限量GB 13078- 飼料衛(wèi)生標準黃曲霉毒素限量標準試劑盒原理專題知識講座第28頁 霉菌毒素殘留限量毒素樣品類型限量 (g/kg)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）谷物及其制品（玉米、玉米面；小麥、小麥粉、大麥、麥片）、豬料、犢牛料、泌乳期料牛料、禽料10005000玉米赤霉烯酮（ZEN）谷物及其制品配合飼料、玉米60500T-2毒素豬配合

12、飼料、禽配合飼料1000赭曲霉毒素（OTA）谷物及其制品；豆類及其制品配合飼料、玉米5100試劑盒原理專題知識講座第29頁第六個別 試劑盒結果分析靈敏度:應用該方法能檢測待測抗原最低量。準確度:指測定值(平均值)與真實值靠近程度,表示分析結果正確性，因為無法知道樣本真實濃度，故通常采取添加回收率來表示。回收率=(測定值-空白值)/添加量精密度:指用某種方法重復測定同一均質(zhì)樣品所得測定值彼此靠近程度,表示分析結果重復性，用變異系數(shù)表示。試劑盒原理專題知識講座第30頁第六個別 試劑盒結果分析檢測限（LOD ）：指分析方法能夠從樣品背景信號中檢測出待測物質(zhì)存在時所需最低濃度。LOD反應了分析方法整體

13、靈敏度效能指標。LOD=B+2SD或B+3SD。（試劑盒中檢測限=靈敏度*樣本稀釋倍數(shù)）定量限（LOQ ）：指分析方法能夠?qū)悠分写郎y物進行定量測定最低濃度。用于定量方法驗證。普通要求其CV10%,回收率80%，LOQ=B+10SD。試劑盒原理專題知識講座第31頁第六個別 試劑盒結果分析殘留檢測限（MRL）：要求樣本中藥品最高不得超出濃度。很多情況下各國要求值之間有一定差異，多數(shù)情況下我國要求值較日本、歐盟、美國高一些。陰性和陽性陰性：即樣本中不含被檢測物質(zhì)陽性：樣本中含有被檢測物質(zhì)假陰性與假陽性假陰性：因為一些原因影響，原本含有被檢測物樣本檢測結果為陰性假陽性：與假陰性情況相反試劑盒原理專題

14、知識講座第32頁第六個別 試劑盒結果分析零標OD值：1.4-2.3，表示產(chǎn)品穩(wěn)定性，過高OD值可能是因為操作失誤引發(fā)。（酶標儀選擇）IC50：半數(shù)抑制濃度。是控制曲線整體形狀關鍵。（是結果穩(wěn)定程度代表參數(shù)）線性（R2值）：代表現(xiàn)有數(shù)據(jù)和方程式趨勢線擬合度，R2越靠近1說明擬合度越好，方程式更符合現(xiàn)有數(shù)據(jù)存在規(guī)律。（不能僅僅以此為依據(jù)判斷結果準確性）試劑盒原理專題知識講座第33頁第六個別 試劑盒結果分析第一抑制率（B1/B0）：75-85%。變異系數(shù)（CV）：CV =（ 標準偏差 SD / 平均值Mean ） 100% 。要求CV10%。尤其注意： 精密度與準確度沒有必定聯(lián)絡。 以上全部參數(shù)均需綜合考量，缺一不可。試劑盒原理專題知識講座第34頁 設備型號 吸光度范圍 檢測類型 Bio-Rad-550（美國伯樂） 0.02.5 紫外檢測 Ultramar