分離科學第一章沉淀法

1、分離科學第一章沉淀法第1頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一1分離科學意義 生產(chǎn)實踐中成本構(gòu)成，工藝過程可能就是分離過程。 環(huán)保尤其是水資源利用 基礎醫(yī)學和臨床醫(yī)學 生物分離的重大前沿意義：多種新的分離技術(shù)和分離方法。本課程授課傾向：與生產(chǎn)實踐相關(guān)，次新的分離技術(shù)的方法原理和應用。主要分離對象是生物樣品和天然產(chǎn)物。第2頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一2沉淀法溶劑萃取法樹脂法膜分離技術(shù)凝膠萃取法雙水相萃取法超臨界流體萃取法泡沫分離法中草藥有效成分分離示例呂家根化學樓1465,1410第3頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一3第一章

2、沉 淀 法為什么會溶解？ 沉淀法是化學工程中最常用和最簡單的提取方法，它是利用加入試劑或改變條件使產(chǎn)物或干擾物離開溶液，生成不溶性顆粒而沉降析出。沉淀和結(jié)晶在本質(zhì)上同屬一種過程，都是新相析出的過程，主要是物理變化，當然也存在有化學反應的沉淀或結(jié)晶。沉淀和結(jié)晶的區(qū)別在于形態(tài)的不同，同類分子或離子以有規(guī)則排列形式而析出稱結(jié)晶，同類分子或離子以無規(guī)則的紊亂排列形式而析出稱為沉淀。 第4頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一4 沉淀法的優(yōu)點為設備簡單、成本低、原材料易得，便于小批量生產(chǎn)，在產(chǎn)物濃度愈高的溶液中沉淀越有利、收率越高；缺點為過濾困難、產(chǎn)品質(zhì)量較低需重新精制。 本章介紹在化

3、學工程中使用的沉淀法主要包括鹽析法，有機溶劑沉淀法，等電點法以及其它沉淀法。第5頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一5等電點法 由于試劑費用低廉，是一些普通的酸或堿，以改變pH值使分部沉淀成為一種工業(yè)方法，同樣是富有吸引力的。 等電點法主要用于一些兩性電解質(zhì)的產(chǎn)物中，例如抗菌素(四環(huán)素)、氨基酸(谷氨酸)以及水化程度不大或憎水性的蛋白質(zhì)例如酪蛋白等，下面我們以谷氨酸為例來討論等電點法的具體應用。第6頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一6 谷氨酸的等電點 谷氨酸分子中合有兩個酸性的羧基和一個堿性的氨基，是一種兩性電解質(zhì)，它在不同pH的溶液中可以至陽離子、兩

4、性離子和陰離子等四種不同的離子狀態(tài)而存在，分別以GA、GA、GA-、GA2-表示。存在有如下平衡關(guān)系。 由實驗測得三個極性基團的表觀電離常數(shù)及pK值： 第7頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一7第8頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一8不同pH時谷氨酸的電離平衡第9頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一9從谷氨酸的各級電離常數(shù)，用電子計算機可以方便求得在不同pH值下各種離子的分配情況。計算公式的導出，令濃度單位為mmoL/mL整理后得：若溶液中谷氨酸的總量為1mmo1，即： 第10頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一

5、10合并得： 令：則：第11頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一11設H+濃度為x則A、B、C、D都是x的函數(shù)，就可用電子計算機進行演算，其結(jié)果描繪成下圖。 第12頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一12從計算機得到的數(shù)據(jù)或上圖，就能得到任一pH值下離子的分配情況，例如當pH值3.22時，GA：GA：GA-：GA2-7.861：84.24，7.861：0.278910-5。若pH達到7左右時，隨著-羧基的電離，谷氨酸主要以陰離子GA-存在，占溶液離子總數(shù)的99.61%，pH值再繼續(xù)升高，隨著-谷氨酸電離，并與溶液中的OH-中和，使谷氨酸以另一種陰離子GA

6、2-存在，在pH值13時，陰離子GA2-占溶液中離子總數(shù)的99.95。從上可見，谷氨酸根據(jù)溶液pH值的不同，可以成為帶正電荷的陽離子，也可以成為帶負電荷的陰離子。當介質(zhì)達到一定的pH值(3.22)時，谷氨酸呈電中性，此時就稱為谷氨酸的等電點。 第13頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一13 在等電點時，谷氨酸分子中氨基和羧基相互中和的結(jié)果，生成一種內(nèi)鹽形式的分子，它可以看成為羧基電離產(chǎn)生的H+與氨基結(jié)合成兩性離子(或偶極離子)，因此谷氨酸的等電點也就是呈電中性時溶液的pH值習慣上以pI表示?？衫闷淇傠婋x平衡常數(shù)值求得。 第14頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1

7、分，星期一14因為在等電點時，溶液中總靜電荷為零，所以GA-GA+，則上式可簡化為 因第15頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一15谷氨酸在等電點時，絕大部分以偶極離子(GA+)狀態(tài)存在，分子內(nèi)部正負電荷相等，并且有等量的帶不同電荷的陽離子(GA+)和陰離子(GA-)，因此，溶液的總靜電荷等于零。谷氨酸分子之間由于相互碰撞并通過靜電引力的作用結(jié)合成較大的聚合體而沉淀。所以在等電點時表現(xiàn)有最低溶解度性質(zhì)見表。工業(yè)生產(chǎn)中等電點法提取谷氨酸，就是利用這一特性。 第16頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一16A ：谷氨酸結(jié)晶L-谷氨酸結(jié)晶屬于斜方晶系離子晶體，具

8、有多晶型性質(zhì)，在不同的條件下，可以得到。型谷氨酸結(jié)晶和型谷氨酸結(jié)晶。由x射線衍射儀測得空間三方向晶軸如下：第17頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一17由表可知-型結(jié)晶晶軸長短接近，因此，晶體粗壯，呈顆粒狀；而-型結(jié)晶，其晶軸長短懸殊，b方向軸特別長，呈針狀或鱗片狀。 -型結(jié)晶是大型結(jié)晶，在純谷氨酸溶液個為斜方六面晶體(觀察等電析出的晶體為四面晶體)。純度高、顆粒大、質(zhì)量重、易沉降、與母液分離容易，是一種理想的結(jié)晶，而-型結(jié)晶晶粒細、純度低、質(zhì)量輕、難沉降、不易沉淀析出，因此在生產(chǎn)中要控制結(jié)晶條件，以析出-型結(jié)晶，如出現(xiàn)-型結(jié)晶則沉淀物細、結(jié)晶不易沉降、分離困難、收率大減。

9、第18頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一18B：影響晶型的條件 1發(fā)酵液中谷氨酸濃度對晶型的影響。由下表所列數(shù)字表明，在室溫自然冷卻條件下隨著谷氨酸含量的升高，-型谷氨酸結(jié)晶增多，水分增多，純度降低，分離因難。第19頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一19 A：谷氮酸的含量 發(fā)酵液中谷氨酸含量在4以上時，等電結(jié)晶操作容易，收率可達60左右，谷氨酸含量太低，如1.5-3.5%常溫下溶液的過飽和率小，結(jié)晶的生成速度慢、收率低，因此，對產(chǎn)酸較低的發(fā)酵液為了提高收率，中和時采取多加高流分(離子交換柱洗脫下的高流液，加酸調(diào)至1.5用于等電中和)，以增加谷氨酸含量

10、；同時在晶核形成前投入晶種，以促進結(jié)晶的形成。此外，也可在去菌體后70下進行真空濃縮，然后再等電點提取，也可采用離子交換柱直接吸附分離，再等電結(jié)晶。 第20頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一20由表可知，析出結(jié)晶的溫度超過30時，-型晶體增加。因此，必須把發(fā)酵液溫度降到30以下，以避免形成-型晶體。2結(jié)晶析出溫度對晶型的影響。第21頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一21B：溫度的影響 谷氨酸的溶解度隨溫度的降低而變小，結(jié)晶析出溫度對晶體型式有很大影響。粒狀的型晶體，結(jié)晶溫度必須降低到30以下，以避免形成型晶體。在等電中和過程中，溫度緩慢下降，結(jié)晶顆粒

11、粗大。降溫過快。結(jié)晶顆粒細小，最后溫度越低越好，可以使谷氨酸充分析出。低溫等電點法，終溫控制在3-5，收率可提高到80左右。由于結(jié)晶過程是放熱反應，溫度較難控制，原則上必須避免溫度回升，溫度的逆轉(zhuǎn)會引起 晶型向晶型的轉(zhuǎn)變，導致收率下降，生產(chǎn)上以控制酸的流加速度來確保溫度的緩慢下降。第22頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一22C：加酸速度的影響加酸的目的在于使pH降低到谷氨酸的等電點。加酸速度的快慢對晶體的大小影響較大。緩慢加酸使谷氨酸的溶解度逐漸下降，晶核的形成不會太多大快，育晶后顆粒大易沉降分離，加酸速度過快，容易形成局部過飽和，晶核形成太快太多，結(jié)晶顆粒小，不易沉降分

12、離，影響收率。操作上一般采用前期加酸稍快，中期(晶核形成前)加酸要緩，后期加酸要慢的原則，直至pH降低至等電點為止。 谷氨酸的溶解度在等電點偏酸時增加較慢，偏堿時增加較快，pH值以控制在3.0-3.2為最好，如低于3.0提取收率也會降低。第23頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一23工廠生產(chǎn)一般用鹽酸中和，如用硫酸易形成型結(jié)晶同時對發(fā)酵液中的Ca2+要進行預處理，以防止硫酸鈣沉淀降低谷氨酸純度，等電點-離子交換法采用高流分調(diào)pH，流加速度一定要慢，防止局部過飽和。 D：晶種 適時投放品種，有利于產(chǎn)品收率的提高。投放晶種的條件要準確，應控制在溶液的介穩(wěn)區(qū)，生產(chǎn)上是根據(jù)含量和P

13、H值來決定投種時間，一般谷氨酸含量為5左右時，在pH4.0-4.5投品種；含量為3.5-4.0時，在pH3.5-4.0投放品種，投種量為發(fā)酵液的0.2-0.3。晶種要求純度高、粒度均勻，投放晶種的目的是控制晶核數(shù)量，使晶體顆粒大，容易分離，提高收率。 第24頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一24E ：育晶養(yǎng)晶在pH4.5-5.0左右，一般就出現(xiàn)晶核，應停止加酸，攪拌育晶2小時晶不斷溶解、在大結(jié)晶顆粒上聚集沉積的過程，可以使產(chǎn)品顆粒粗大。 F ：攪拌的影響 在不攪拌的情況下自然起晶，晶體的大小不均勻。采用緩慢冷卻，適當攪拌?？墒箿囟群蚿H均勻，有利于晶體長大，減少顆垃的互相

14、粘連使晶體均勻一致，避免晶接的形成。但攪拌太快，翻動激烈，會引起晶體的磨損，結(jié)果晶體細??；太饅，溫度和pH值不均勻，局部晶核過多，晶體也會細小，攪拌轉(zhuǎn)速與設備直徑和攪拌槳葉大小有關(guān)，一般以20一30轉(zhuǎn)分為宜。生產(chǎn)上采用槳式攪拌器，二擋交叉安裝。 第25頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一25G：殘?zhí)堑挠绊?發(fā)酵液殘?zhí)歉?，易產(chǎn)生型品體，因此殘?zhí)呛吭降驮胶?，有利于提高等電點結(jié)晶的收率。如殘?zhí)翘呖蛇m當增加高流分提高溶液中谷氨酸含量，以擴大谷氨酸與殘?zhí)侵戎担欣诰w的形成。 H：菌體的影響糞產(chǎn)堿桿菌發(fā)酵液中殘存的菌體的大小及數(shù)量，因菌種不同而異。AS1.542菌發(fā)酵后，菌體

15、大，數(shù)量少，質(zhì)量輕，易于分離；而Asl229菌體數(shù)量多而且重，難分離，故采用等電點提取谷氨酸時，宜用AS1.542菌。第26頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一26I ：染菌的影響 對于染菌和噬菌體感染都會降低純度和收率，使操作圍難，所以要防重于治，嚴格操作、酵液及時處理，保證新鮮不腐敗。此外，發(fā)酵液中有L-天冬氨酸、苯丙氨酸等氨基酸存在時，能促進型晶體的生成，鈣鹽、鎂鹽等雜質(zhì)對谷氨酸結(jié)晶也有影響，Ca2含量達到0.34克100毫升時就會影響谷氨酸的結(jié)晶析出。 第27頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一27為什么會有溶解度？鹽析法又稱中性鹽沉淀法，在溶液

16、中加入中性鹽能破壞蛋白質(zhì)或酶的膠體性質(zhì)，消除微粒上的電荷，促使蛋白質(zhì)或酶沉淀，此法一般應用于蛋白質(zhì)分離和酶制劑工業(yè)的發(fā)酵液提取。鹽析原理 蛋白質(zhì)或酶溶液是復雜的膠體系統(tǒng)，由兩相組成：液體分散介質(zhì)和固體分散內(nèi)相(即分散物質(zhì))，分散內(nèi)相的顆粒大小為1-100毫微米（納米）。鹽析法第28頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一28膠體溶液不是穩(wěn)定的，在一定的條件下，它們的顆粒能相聚結(jié)而沉降。所以首先應對膠體溶液的形成有所了解： 在蛋白質(zhì)或酶的顆粒表面分布著各種親水基團，如-NH2，-OH，這些親水基團吸聚著許多水分子，這種作用稱為水合，水分子在顆粒表面形成一層水膜(溶劑化膜)，由于水

17、膜的存在，顆粒間被分隔開，水膜愈大，膠體溶液愈穩(wěn)定。同時像蛋白酶等酶分子中，含有不同數(shù)目的酸性和堿性氨基酸，其肽鏈的兩端有不同數(shù)目的自由羧基和氨基，這些基團使蛋白酶顆粒表面帶有一定的電荷，因相同電荷的排斥作用，也使顆粒彼此分離，所以蛋白酶水溶液是一種穩(wěn)定的親水膠體溶液，如果在溶液中加入一定量的促淀劑，由于沉淀劑(NH4)2S04的親水性比蛋白質(zhì)或酶的親水性大，它能與大量的水分子結(jié)合，使水膜退化、消失而脫水， 第29頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一29同時由于(NH4)2S04的解離，中和了蛋白質(zhì)或酶顆粒所帶的電荷，顆粒間失去相互的排斥力，在布朗運動的互相碰撞下，蛋白質(zhì)或

18、酶分子結(jié)合成聚集物而沉淀析出，其機理可用圖：第30頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一30從上述機理可見，蛋白質(zhì)或酶的沉淀是由于鹽類的加入使其溶解度變化所致，根據(jù)實際的觀測，在濃鹽溶液中蛋白質(zhì)的溶解度和溶液離子強度呈下列關(guān)系：蛋白質(zhì)的lgs 與離子強度 r/2關(guān)系圖第31頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一31由圖可見值為外推值，為蛋白質(zhì)在純水的溶解度對數(shù)值，它取決于蛋白質(zhì)的種類，也和溶液的溫度及pH值有關(guān)，與鹽的種類無關(guān)。而K值主要由蛋白質(zhì)的性質(zhì)與鹽的種類決定，而與溶液的pH和溫度無關(guān)。因此用鹽析法分離蛋白質(zhì)時可以有兩種步驟： 1在一定的pH及溫度條件

19、下，改變鹽的濃度(即離子強度)達到沉淀的目的，稱為“K”分級鹽析法。 2在一定的離子強度下，改變?nèi)芤旱膒H及溫度達到沉淀的目的，稱為“”分級鹽析法。一般粗提蛋白質(zhì)時常用第l法，進一步分離、純化時常應用第2法。第32頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一32影響蛋白質(zhì)鹽析的主要因素： 影響蛋白質(zhì)鹽析的主要因素有鹽析劑的種類和用量，溶液的溫度和pH值。此外溶液中各種雜質(zhì)的種類和數(shù)量，對蛋白質(zhì)的溶解度都有直接的關(guān)系，這些關(guān)系是相當復雜而微妙的，具體問題必須通過實驗加以解決。下面就一般情況加以介紹。 第33頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一33 A：鹽析劑的種類

20、 可供選擇的鹽析劑種類很多，如MgSO4、(NH4)2S04、Na2S04、NaH2P04等，不同的鹽其鹽析效果是各不相同的。其中效果最好又最常用幾種鹽的鹽析效果順序如上。一般來說，含有多價陰離子的中性鹽的鹽析效果較好。但即便是同一種鹽對不同品種的酶其鹽析效果也不相同，具體情況必須具體分析。生產(chǎn)上最多用的鹽析劑是硫酸銨，這是因為它在較低溫度時，溶解度也相當高. B：鹽析劑的用量 鹽析劑的用量與所沉淀的酶的種類和酶液中雜質(zhì)的性質(zhì)、數(shù)量有關(guān)，應以收率最高的用量為標準。具體用量需通過對比試驗和生產(chǎn)實踐摸索才能確定。如目前生產(chǎn) 第34頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一34淀粉酶(

21、BF7658)，鹽析劑硫酸銨的用量為40；而生產(chǎn)葡萄糖氧化酶、硫酸銨的用量需高達70。 由于硫酸銨用量大，且易吸濕結(jié)塊，不易溶解，為了能夠快速溶解，用前需加以粉碎，然后邊溶解邊加到酶液中，加鹽的速度應盡可能避免鹽析劑積聚罐底。攪拌能加快鹽的溶解和加速膠體溶液的破壞，有利于酶的沉降，但強烈的攪拌會產(chǎn)生泡沫，引起酶蛋白質(zhì)的表面變性和氧化使酶液活力下降，并且會使沉淀破碎，形成細小顆粒，沉降不完全，進而增加過濾的困難，所以應該適中。 C：鹽析的溫度 鹽析時溫度的選擇要以不降低酶的活力為原則，應在其保持穩(wěn)定的溫度范圍內(nèi)進行鹽析，但也需適當?shù)仡櫦胞}析效果，可以根據(jù)實驗結(jié)果決定，一般規(guī)律是溫度愈低沉淀的形成

22、愈不容易但也有相反的情況。實際上可供選擇的 第35頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一35范圍較大，所以多數(shù)是在常溫下進行鹽析。 D：鹽析的pH值 鹽析的pH選擇也要以不降低酶的活力為原則。同樣也要通過試驗決定，加鹽后的酶液形成沉淀的pH值(等電點)與原來酶液相比改變不大。由于蛋白質(zhì)在等電點時最易沉淀，故可選擇等電點的pH值作為鹽析的pH值。但為防pH值對酶活力的影響，可通過試驗選擇在酶穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)進行鹽析。 E：溶液中雜質(zhì)的影響 酶液中雜質(zhì)的組成以及這些成分對鹽衍效果的影響是極為復雜的，尤其是溶液中所含的各種蛋白質(zhì)和其它酶對需要提取的酶會相互作用。鹽析條件的選擇應以最

23、大可能沉淀出需要的酶為原則，要通過試驗具體選擇。此外，特別重要的是重金屬離子的影響，重金屬的存在會導致酶的大量損失。例如，所用器具產(chǎn)生銅銹可使酶活力大幅度 第36頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一36降低，根據(jù)試驗，十萬分之一的硫酸銅會使脂肪酶的活力損失90左右。人為因素帶來的雜質(zhì)應當盡量避免，發(fā)酵液的貯放不能太久應及時處理，否則進一步發(fā)酵和雜菌孳生都會降低酶液的活力。第37頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一37用硫酸銨鹽析法生產(chǎn)蛋白酶制劑 嗜堿性芽孢桿菌分泌 第38頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一38有機溶劑沉淀法 有機溶劑

24、沉淀法常應用于酶制劑、氨基酸、抗生素等發(fā)酵產(chǎn)物的提取上。下面我們談酶的有機溶劑沉淀法。有機溶劑沉淀原理 有機溶劑如丙酮、乙醇、甲醇等使蛋白質(zhì)、酶等沉淀，早期人們認為是由于加入溶劑后，使溶液的介電常數(shù)降低，因而使蛋白質(zhì)或酶分子間靜電引力(庫侖力)增大。后來又提出了另一種說法，認為是由于蛋白質(zhì)或酶的溶劑化，使原來和蛋白質(zhì)或酶結(jié)合的水為溶劑所取代因而降低了它們的溶解度，但是這種理論不能說明許多問題。 第39頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一39 何以丙酮、乙醇之類溶劑在所謂脫去蛋白質(zhì)或酶水膜的過程中容易使它們變性、而鹽析脫水時不造成它們的變性呢?事實證明丙酮、乙醇等有機溶劑不僅

25、是蛋白質(zhì)或酶的沉淀劑，更重要的還是它們的一種變性劑，可見有機溶劑使蛋白質(zhì)或酶沉淀和變性之間有區(qū)別又相關(guān)聯(lián)。 近來對蛋白質(zhì)或酶變性的研究有所發(fā)展，有可能對有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)或酶的機理作出新的探索，有機溶劑可能破壞蛋白質(zhì)或酶的某種鍵如氫鍵，使其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某種程度的變形，致使一些原來包在內(nèi)部的疏水基團暴露于表面并與有機溶劑的疏水基團結(jié)合形成硫水層，從而使蛋白質(zhì)或酶沉淀，當?shù)鞍踪|(zhì)或配的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變形超過一定程度就會導致完全的變性。可見，必須把有機溶劑使蛋白質(zhì)或酶沉淀和變性之間的關(guān)系有機地結(jié)合起來，才能正確地闡明其機理。第40頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一40有機溶劑沉淀法

26、的優(yōu)點是某些蛋白質(zhì)沉淀的濃度范圍相當廣，所得產(chǎn)品的純度較高，從沉淀的蛋白質(zhì)或酶中除去有機溶劑是很方便的，而且有機溶劑本身可部分地作為它們的殺菌劑，因而使有機溶劑法有可能用于大規(guī)模的蛋白質(zhì)分級過程中。缺點是需要耗用大量的溶劑，溶劑的來源，庫存都比較困難或麻煩，并且提煉操作需在低溫下進行，使用上有一定的局限性也比鹽析法低。影響沉淀的因素 有機溶劑沉淀法其影響的因素是多方面的，如溶劑的種類和用量、沉淀的溫度、pH值和時間，溶液中的鹽類，吸附劑的性質(zhì)和用量等。不同有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)的效率，受蛋白質(zhì)的種類、溫度、pH和雜質(zhì)等因素所影響，但大致上以丙酮為最佳，乙醇次之，甲醇更次，具體要通過試驗加以選擇。第

27、41頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一41 乙醇是最常用的沉淀劑在沉淀過程中乙醇與水混合時放出大量的稀釋熱，使溶液的溫度顯著升高。對不耐熱的酶影響較大，生產(chǎn)上常用攪拌、少量多次加入的辦法，以避免溫度驟然升高損失酶活力。有機溶劑對酶的沉淀能力也受到溫度的影響，一般溫度越低沉淀越完全，所以沉淀過程必須注意冷卻降溫，使沉淀在較低的溫度下進行。 用有機溶劑沉淀酶類有產(chǎn)生變性的可能，尤其是在還沒有沉淀之前，這種可能性更大。所以在加溶劑時要攪拌均勻，其量不能一下子過多，以防局部濃度過高，引起酶的失活，并且又要在形成沉淀之前，盡可能快速加完，以縮短溶劑與酶的接觸時間，沉淀完全后，應立即

28、壓濾和烘干，盡快除去濕酶中的有機溶劑。 在沉淀過程中，加入一些對酶有保護作用的鹽類，對減少酶活的損失，提高收率十分有利，并且還可以使沉淀物凝聚而易于過濾。所以在酶沉淀前先用適量的磷酸二氫鈉 Why?第42頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一42和氯化鈣進行熱處理，再用乙醇沉淀，有利于過濾的進行。 如果在有機溶劑沉淀的同時還用吸附的辦法，則要注意吸附劑及其用量和吸附溫度的選擇：由于酶的作用，底物對酶有保護作用，所以一般采用底物作吸附劑，不同吸附劑的吸附能力不同，在用淀粉作吸附劑時，玉米淀粉的吸附力較大，應采用增加吸附劑用量和在較低溫度下吸附，則效果較好。以濕淀粉作吸附劑時、應

29、先經(jīng)80-l00加熱或加l0硫酸鈉于98處理，20分鐘后使用。 從上可見，無論是鹽析法，還是有機溶劑法沉淀產(chǎn)物都存在著一定的問題，所以近年來采用可溶性天然或合成的聚合物和多聚電解質(zhì)來沉淀產(chǎn)物，此法在回收、精制中起著愈來愈大作用。第43頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一43A 多聚電解質(zhì)法 聚乙烯亞胺、羧甲基纖維素和離子型多糖如肝素等。如用聚丙烯酸可逆沉淀蛋白質(zhì)的現(xiàn)象，可以作為分離和精制某些酶工業(yè)技術(shù)的基礎(乳糖酶、溶菌酶、淀粉酶等等)，這些沉淀劑的作用，同離子交換色譜一樣，與蛋白質(zhì)上的凈電荷以及聚電解質(zhì)的大小和電荷密度有關(guān)，蛋白質(zhì)分子的相反電荷與聚電解質(zhì)結(jié)合，形成一個多分

30、子絡合物，當絡合物超過游離蛋白質(zhì)的溶解度極限值時，就發(fā)生沉淀。B 水溶性非離子型聚合物法 用聚乙二醇沉淀酵母的酶浸出液研究表明，離子強度以及溶液的pH和蛋白質(zhì)的濃度響應這個過程。在蛋白質(zhì)濃度相當?shù)蜁r發(fā)生分級，在蛋白質(zhì)濃度高時發(fā)生通常的沉淀。 聚電解質(zhì)沉淀法第44頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一44顯然使用聚乙二醇比鹽析要好。在工業(yè)規(guī)模上用聚乙二醇分級已成功地應用在制取高純度的L-天門冬酰胺酶上收率為83.7。 除了上述列舉的沉淀蛋白質(zhì)的聚合物以外，還有其它的帶電聚合物，如DEAE-右旋葡糖，聚乙烯胺，右旋葡糖和精朊的硫酸鹽等等。 第45頁，共76頁，2022年，5月20

31、日，11點1分，星期一45金屬離子沉淀法金屬離子的沉淀作用是由子它們能與蛋白質(zhì)分子中的特殊部位起反應造成的。例如鋅易與組胺酸殘基中的咪唑基結(jié)合，使蛋白質(zhì)的等電點轉(zhuǎn)移，從而降低蛋白質(zhì)的溶解度。金屬離子沉淀蛋白質(zhì)，一般可分為三類：第一類為能與羧基、胺基等含氮化合物以及含氮雜環(huán)化合物強烈結(jié)合的一些金屬離子，如Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+；第二類為能與羧酸結(jié)合而不與含氮化合物結(jié)合的一些金屬離子，如Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+；第三類為與疏基化合物強烈結(jié)合的一些金屬離子，如Hg2+、Ag+、Pb2+。實際應用時，金屬離子的濃度常為0.02mol/L。復合

32、物中金屬離子的去除，可用離子交換法或EDTA金屬螯合劑。第46頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一46例子：四環(huán)素類抗生素在堿性條件下能和鈣、鎂、鋇等重金屬離子或溴代十五烷基吡啶生成沉淀；青霉素可與N，N二芐基乙二胺、三乙胺、N乙基吡啶和環(huán)己胺等有機堿形成難溶的鹽；新霉素可以和強堿性表面活性劑、環(huán)桿菌素可用工業(yè)陰離子去污劑形成難溶性復合物等等 第47頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一47 親和沉淀是分離過程的一部分，但是其沉淀原理與通常的沉淀方法有很大的不同。它是利用蛋白質(zhì)與特定的生物的或合成的分子(免疫配位體、基質(zhì)、輔酶等)之間高度專一的相互作用而設

33、計出來的一種特殊選擇性的分離技術(shù)，所以其沉淀原理不是依據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異，而是依據(jù)“吸附”有特殊蛋白質(zhì)的聚合物的溶解度的大小。親和過程提供了一個從復雜混合物中分離提取出單一產(chǎn)品的有效方法。這個技術(shù)包含有三個步驟：在初始階段，將一個目標蛋白質(zhì)與鍵合在可溶性載體上的親和配位體絡合形成沉淀；所得沉淀物用一種適當?shù)木彌_溶液進行洗滌，洗去可能存在的雜質(zhì)；用一種適當?shù)脑噭⒛繕说鞍踪|(zhì)從配位體中離解出來。親和沉淀第48頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一48核酸的分離和純化 （附影像教材）核酸分離的步驟。1.溶解細胞 溶解細胞的方法因標本不同而不同。有的是用十二烷基硫酸鈉（sodium

34、 dodecyl sulfate,SDS）加NaOH，有的是用蛋白酶，有的用超聲波破碎等方法。2有機溶劑抽提 利用苯酚提取主要使蛋白質(zhì)變性沉淀于有機相，而核酸保留在水相，達到分離核酸的目的。實際上生物標本中含量最多的就是蛋白質(zhì)。3.純化 為了得到純的核酸，可用蛋白酶除去蛋白；用RNA酶除去RNA，得到純的DNA；用DNA酶除去DNA，得到純的RNA。4.沉淀 為了除去分離過程中殘留的有機溶劑，常用的方法是加冷乙醇和鹽沉淀核酸，再通過離心回收核酸，然后用80%乙醇洗滌沉淀，除去多余的鹽，以免影響核酸溶解和抑制后續(xù)步驟的酶促反應。第49頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一49沉

35、淀法在中草藥提取中的應用沉淀法是在中草藥提取液中加入某些試劑使其析出其中某種或某些成分，或析出其雜質(zhì)，產(chǎn)生沉淀，以獲得有效成分或除去雜質(zhì)的方法，包括醇沉法、酸堿沉淀法、鉛鹽沉淀法等。 1醇沉法 中草藥的水提液中常含有樹膠、黏液質(zhì)、蛋白質(zhì)、淀粉等，可以加入一定量的乙醇，使這些不溶于乙醇的成分從溶液中沉淀析出，而達到與其他成分分離的目的。例如自中草藥提取液中除去這些雜質(zhì)，或從白及水提液中獲得白及膠，都是采用乙醇沉淀法。丙酮在蛋白質(zhì)、多糖的提取中也常做沉淀試劑，如自新鮮栝樓根汁中制取天花粉蛋白，可滴入丙酮使分次沉淀析出。另外，提取多糖及多肪類化合物，也多采用水溶解、濃縮、加乙醇或丙酮析出的辦法。 第

36、50頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一50實例1 栝樓中天花粉蛋白的分離 取新鮮栝樓根刨去表皮，壓汁，汁液放置過夜后離心，上清液加等量乙醇有沉淀析出，離心除去，母液再加0.5倍量乙醇，離心收集此部分沉淀，仍含雜質(zhì)。再于此母液中加1倍量的乙醇，則析出較純的蛋白質(zhì)沉淀，蛋白質(zhì)用水溶解，冷凍干燥，即為天花粉蛋白純品。 第51頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一512酸堿沉淀法 酸堿沉淀法是利用某些成分能在酸或堿液中溶解，當加堿或加酸調(diào)整溶 液的pH后，所需成分又恢復回原來結(jié)構(gòu)，成不溶物而析出以達到分離的目 的(具體操作見溶劑分離法)。 實例2 蝙蝠葛中提取蝙

37、蝠葛堿 取蝙蝠葛粗粉，以0.55的硫酸水溶液溫熱浸提2次，合并提取液，用濃氨水堿化至pH 9.0一9.5，然后用苯萃取，合并苯液，再以2的鹽酸萃取苯溶液，合并酸水萃取液，用氨水調(diào)pH為9，產(chǎn)生沉淀，過濾，水洗至 中性，60下烘干，即得蝙蝠葛堿成品。 第52頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一523鉛鹽沉淀法 鉛鹽沉淀法是分離某些中草藥成分的經(jīng)典方法之一。由于中性醋酸鉛或堿式醋酸鉛在水及醇溶液中，能與多種中草藥成分生成難溶的鉛鹽或絡合物沉淀，故可利用這種性質(zhì)使右效成分與雜質(zhì)分離。中性醋酸鉛能與酸性成分或某些酚類物質(zhì)結(jié)合成不溶性鉛鹽。因此常用于沉淀有機酸、氨基酸、蛋 白質(zhì)、黏液

38、質(zhì)、鞣質(zhì)、樹脂、酸性皂苷、部分黃酮等。堿式醋酸鉛產(chǎn)生不溶性鉛鹽或絡合物的范圍更廣。通常將中草藥的第53頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一53水或酸提液先加入醋酸鉛濃溶液，靜置后濾出沉淀。然后將鉛鹽沉淀懸浮于新溶劑中，通以硫化氫氣體， 使鉛轉(zhuǎn)為不溶性硫化鉛而沉淀除去。硫化氫脫鉛比較徹底，但溶液中多余的硫化氫，必須通人空氣或二氧化碳讓氣泡帶出，以免在處理溶液時參與化學 反應。新生態(tài)的硫化鉛多為膠體沉淀，能吸附藥液中的有效成分，要注意用溶劑處理收回。另外，也可用硫酸、磷酸、硫酸鈉、磷酸鈉等方法除鉛，但不如硫化氫除鉛徹底。陽離子交換樹脂也可以用來脫鉛，快而徹底，但藥液中某些有效成

39、分也可能被交換上去，造成吸附損失。 第54頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一54實例3 槲樹皮中槲皮苷的提取 槲樹(Qucercus dentata Thunb)皮的乙醇提取液，先加入少量中性醋酸鉛溶液，攪拌均勻，析出暗棕色沉淀，濾除沉淀(含大量雜質(zhì)和少量槲皮苷)，于濾液中繼續(xù)加入中性醋酸鉛溶液至不再產(chǎn)生橙黃色沉淀。過濾收集沉淀，洗凈后，懸浮于乙醇中，通入硫化氫至鉛鹽全部分解過濾，蒸干濾液，得黃色殘渣，溶于熱水中，濾除不溶物，放冷，槲皮苷即結(jié)晶析出。第55頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一55 除上述沉淀方法外，蛋白質(zhì)還可以等電點沉淀析出，如某些蛋白

40、質(zhì)溶液，可以變更溶液的PH、利用其在等電點時溶解度最小的性質(zhì)而使之沉淀析出。此外，還可以用明膠、蛋白溶液沉淀鞣質(zhì)；膽甾醇也常用以沉淀洋地黃皂苷等。沉淀試劑可根據(jù)中草藥有效成分和雜質(zhì)的性質(zhì)，適當選用。 作為一種初步的純化方法沉淀法也經(jīng)常被用在皂苷的研究中，將含有皂苷的提取物(如經(jīng)丁醇-水分配之后)的濃縮的甲醇溶液倒人大量的乙醚中，利用過濾或離心的方法收集沉淀的皂苷，反復利用這種方法，可以得到很好的分離效果(Hostettmann和Marston，l995)。第56頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一56鹽析法是在中草藥的水提液中加入無機鹽使之達到一定的濃度或半飽和或飽和狀態(tài)后

41、，可使提取液中的某些成分在水中的溶解度降低而沉淀析出， 從而達到與水溶性大的雜質(zhì)分開的種分離方法。一般的生物堿、皂苷、揮發(fā)油等都可用鹽析從水溶液中分離出來。常用作鹽析的無機鹽有氯化鈉、氯 化鉀、氯化鈣、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨、碳酸鉀等。例如在三七的水提取液中加硫酸鎂至飽和狀態(tài)，三七皂苷乙即可沉淀析出；從大麥中提取淀粉酶也是加入硫酸銨鹽析；從黃藤中提取掌葉防己堿，三顆針中提取小蘗堿都可用氯化鈉或硫酸銨鹽析制備；有些水溶性較大的成分如原白頭翁素、麻黃堿、苦參堿等，在提取時，亦往往先在水提取液中加入一定量的氯化鈉，再用有機溶劑萃取。 第57頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一57

42、實例4 大麥中提取淀粉酶大麥（hordeum vulgare)種子在25-27發(fā)芽7d，麥芽搗碎，壓汁，在汁液中加入硫酸銨鹽析，沉淀物冷凍干燥，磨粉。即為淀粉酶。第58頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一58利用物質(zhì)揮發(fā)性的差異分離共存組分。揮發(fā)法是將氣體和揮發(fā)組分從液體或固體樣品中轉(zhuǎn)變氣相的過程，它包括蒸發(fā)、蒸餾、升華、氣體發(fā)生和驅(qū)氣，有時有稱之為氣態(tài)分離法。蒸餾主要用于物質(zhì)組分的分離提純或制備。蒸餾與揮發(fā)第59頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一59第60頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一60一、 蒸餾蒸餾是基于氣液平衡的原理將

43、物質(zhì)的組分分離。蒸氣相的富集程度隨二組分相對蒸氣壓的大小而定。簡單的蒸餾技術(shù)只能使二組分部分分離，沒有一相是純凈的。分餾技術(shù)可將二組分分離并得到所需的純度。第61頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一61普通蒸餾法基于物質(zhì)的揮發(fā)性和沸點的差異進行分離是最常用的制備和提純試劑的方法實驗室中常用蒸餾法提純鹽酸、硝酸、氫溴酸、氫碘酸、高氯酸和硫酸等。 第62頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一62亞沸蒸餾技術(shù)亞沸蒸餾是近代發(fā)展起來的蒸餾技術(shù)。該方法主要持點是用紅外燈或電熱絲從上方加熱提純液態(tài)物質(zhì)，使液體在低于沸點條件下表面蒸發(fā)，從而避免沸騰狀態(tài)下氣泡自液體底部上

44、升，使母液的霧狀顆粒不致于帶入餾出液中。常用石英亞沸蒸餾器提純水、鹽酸、硝酸、高氯酸，用聚四氟乙烯亞沸蒸餾器提純氫氟酸。第63頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一63第64頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一644. 利用形成恒沸混合物的蒸餾例：乙醇與水的分離95%乙醇5H2O，恒沸點78。加苯作為夾帶劑形成一沸點更低的的恒沸點混合物，除去5的水。第65頁，共76頁，2022年，5月20日，11點1分，星期一65二、 揮發(fā)分離 兩大類： (1)直接蒸餾揮發(fā)一種或一種以上的組分。 主要用于揮發(fā)性相差懸殊的組分。 (2)將各組分轉(zhuǎn)化為具有不同揮發(fā)性的化合物。在適當溫度下用活性氣態(tài)試劑處理、使主要組分或痕量組分可以蒸餾揮發(fā)；用適當?shù)姆椒ǚ纸鈽悠?，使有關(guān)組分轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)的化合物。最常見的試劑是氟、氯、溴或者鹵化氫等。第66頁，共