大學《醫(yī)學微生物學基礎(chǔ)》期末復習重點、考點總結(jié)-第六章：抗細菌與病毒免疫、第七章：微生物學檢查方法

1、抗細菌與病毒免疫 第一節(jié) 抗細菌免疫一、固有免疫 屏障結(jié)構(gòu) 吞噬細胞 體液因素屏障結(jié)構(gòu) 1皮膚與粘膜屏障 （1）機械性阻擋 （2）分泌殺菌物質(zhì) （3）正常菌群的拮抗作用 2. 血腦屏障 3. 胎盤屏障吞噬細胞 小吞噬細胞 外周血中的中性粒細胞大吞噬細胞 血中的單核細胞和各種組織中的巨噬細胞（單核吞噬細胞系統(tǒng)） 1 .吞噬和殺菌過程（1） 趨化、識別與結(jié)合： 細菌LPS、趨化因子、 IL-8、NAP-2、MIP等細胞因子吸引吞噬細胞穿過毛細血管壁聚集到感染部位。吞噬細胞表面的模式識別受體（pattern recognition receptor,PRR）通過識別結(jié)合病原體表面的病原相關(guān)分子模式（

2、pathogen associated molecular pattern, PAMP)而利于吞噬細胞捕獲病原微生物，并可誘導促炎細胞因子的表達TLRs 包括細胞表面的（ TLRs1,2,4,5,6）和細胞內(nèi)溶酶體、內(nèi)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的TLRs（TLRs3,7,8,9）， TLRs識別后能增強吞噬和殺傷能力，促進細胞因子、趨化因子和抗微生物肽的分泌；調(diào)節(jié)APC成熟和T細胞分化，影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答。甘露糖受體 識別結(jié)合細菌表面的甘露糖和巖藻糖殘基清道夫受體 與細菌表面成分結(jié)合，清除血循環(huán)中的細菌（2）吞噬：直接吞噬 吞噬細胞的細胞膜內(nèi)陷或伸出偽足將病原體包裹并攝入細胞質(zhì)內(nèi)。間接吞噬 Fc 或C3b介導

3、調(diào)理吞噬。（3）消化：吞噬體與溶酶體融合形成吞噬溶酶體，在溶菌酶、髓過氧化物酶、防御素、活性氧中介物和活性氮中介物的作用下殺死細菌。蛋白酶、脂酶、多糖酶將菌進一步分解。2.吞噬細胞殺傷機制（1）氧依賴機制1 呼吸爆發(fā)：在吞噬作用激發(fā)下氧的代謝活躍，O2耗增加，分子氧在還原型輔酶的作用下生成活性氧中間物，包括O2-、1O2 、 H2O2 、HOCL和NH2CL等。這些物質(zhì)有較強的殺菌作用。 2 過氧化氫-髓過氧化物酶-鹵化物殺菌系統(tǒng) 髓過氧化物酶作用于H2O2和氯化物，使菌體蛋白鹵化 而細菌死亡。3 一氧化氮系統(tǒng) 吞噬細胞活化后產(chǎn)生一氧化氮合酶，催化精氨酸產(chǎn)生NO，在氧分子存在下，生成NO2-、

4、NO3-，具有抗菌能力。（2）非氧依賴機制 溶酶體中的溶菌酶、防御素、乳鐵蛋白、蛋白水解酶、酯酶、核酸酶等發(fā)揮殺菌作用。3.吞噬作用的結(jié)果完全吞噬不完全吞噬 T細胞分布于皮下和粘膜組織，識別感染細胞表達的熱休克蛋白、脂類抗原-CD1復合物、某些病毒蛋白、磷酸化非肽分子等具有TH和CTL雙重功能，對胞內(nèi)菌和病毒感染發(fā)揮第一道防線作用。非特異性免疫分子補體 經(jīng)典途徑、替代途徑和甘露糖結(jié)合凝集素途徑三條途徑激活C，形成膜攻擊復合物導致細菌裂解。溶菌酶 主要來源于吞噬細胞，廣泛存在于血清、淚液、唾液、乳汁和腸液，作用于G+肽聚糖。 防御素 破壞細胞膜裂解細菌。急性期蛋白 在IL-6和LPS的刺激下，肝

5、細胞合成脂多糖結(jié)合蛋白、甘露糖結(jié)合凝集素、C反應(yīng)蛋白等，與細菌結(jié)合可促進吞噬或激活補體。還刺激炎性細胞因子引起炎癥反應(yīng)。二、適應(yīng)性免疫抗胞外菌感染免疫 胞外菌 主要寄居在宿主細胞外的血液、淋巴液 和組織液中的病原菌，以產(chǎn)生內(nèi)外毒素和引起炎癥致病。1.黏膜免疫系統(tǒng)的作用 病原體與黏膜免疫系統(tǒng)中的M細胞結(jié)合被內(nèi)吞，然后將病原體提呈給APC，在由APC將抗原提交淋巴細胞引起免疫應(yīng)答，產(chǎn)生分泌型IgA。2. 抗體的作用 阻止細菌粘附 調(diào)理吞噬（調(diào)理素） 中和細菌外毒素（抗毒素） 抑制細菌對營養(yǎng)素的同化作用抗胞內(nèi)菌感染免疫 胞內(nèi)菌 主要寄居在細胞內(nèi)的細菌。包括兼性胞內(nèi)菌和專性胞內(nèi)菌。感染特點 細胞內(nèi)寄生

6、，低毒性、呈慢性感染過程，常有肉芽腫形成，多伴有遲發(fā)型超敏反應(yīng)感染的免疫：T細胞為主的細胞免疫CD4 Th1細胞產(chǎn)生細胞因子，活化巨噬細胞、CTL、引起遲發(fā)型超敏反應(yīng)CD8 CTL穿孔素、顆粒酶破壞感染的細胞，使細菌散出，再被抗體或補體的調(diào)理作用被吞噬細胞消滅。第二節(jié) 抗病毒免疫一、固有免疫1、干擾素（interferon,IFN）定義：由病毒或其他干擾素生劑誘導人或動物細胞產(chǎn)生的的糖蛋白，具有抗病毒等作用IFN誘生劑：病毒、細胞內(nèi)繁殖的微生物、內(nèi)毒素、原蟲、人工合成的雙鏈RNA等，其中以病毒和人工合成的雙鏈RNA誘生能力最強。3.種 類： 種類產(chǎn)生細胞 抗病毒 抗腫瘤 免疫調(diào)節(jié) 人白細胞 強

7、 弱 弱 人成纖維細胞 強 弱 弱 T細胞 弱 強 強抗病毒特點： 抑制而不能殺滅病毒具有種屬特異性對不同病毒的敏感性有差別4.抗病毒機制：病毒或IFN誘生劑作用于宿主細胞，激活I(lǐng)FN基因使IFN表達，IFN釋放后作用于細胞IFN受體，經(jīng)信號轉(zhuǎn)導激活抗病毒蛋白基因，產(chǎn)生抗病毒蛋白而抑制mRNA轉(zhuǎn)錄或蛋白合成。2-5A合成酶途徑 ： 在dsRNA存在條件下2-5A合成酶被活化，使ATP形成2-5A， 2-5A激活RNA酶L或F，切斷病毒mRNA。蛋白激酶途徑：在dsRNA存在條件下，PKR使蛋白質(zhì)合成的啟始因子 eIF-2 的亞基磷酸化，從而抑制病毒蛋白合成。NK細胞在感染早期（4 h）發(fā)揮作用

8、；不受MHC限制；不依賴于特異性抗體NK釋放穿孔素、絲氨酸脂酶、細胞因子TNF等殺傷病毒感染細胞。被IFN激活后增強殺傷作用。二、適應(yīng)性免疫體液免疫1 抗體對游離病毒的作用 中和抗體 改變病毒的表面構(gòu)型或與吸附表位結(jié)合，阻止病毒吸附細胞； 與病毒形成復合物易于被吞噬和清除； 與無包膜病毒結(jié)合而被覆蓋，阻止病毒脫殼 與有包膜病毒結(jié)合，激活補體使病毒裂解。2 抗體對感染細胞的作用 包膜病毒感染細胞后，細胞膜出現(xiàn)病毒抗原，抗體與之結(jié)合，在補體的參與下裂解細胞；調(diào)理作用促進吞噬細胞吞噬。 抗體與病毒感染細胞結(jié)合，通過ADCC作用被NK和巨噬細胞殺傷。細胞免疫 1.CTL的作用 釋放穿孔素、絲氨酸脂酶和

9、高表達FasL殺傷病毒感染細胞。 2.Th1細胞的作用 活化的Th1細胞分泌IL-2 、 IFN、 TNF等，活化NK、CTL、巨噬細胞，增強殺傷能力； IFN可增強MHC、蛋白激酶、2-5A合成酶等抗病毒蛋白表達。免疫病理作用損傷宿主細胞超敏反應(yīng)自身免疫性疾病第七章 微生物學檢查方法 標本的采集和送檢1 采集標本時應(yīng)無菌操作2 采集病變明顯部位或感染部位3 適宜時間與部位4 在抗生素用前取細菌標本5 檢查血清IgG抗體應(yīng)取雙份血清6 盡快送檢第一節(jié) 細菌感染的檢查1. 細菌形態(tài)學檢查顯微鏡放大法 普通光學顯微鏡、電子顯微鏡、暗視野顯微鏡等染色法 革蘭染色法、抗酸染色法、單染色法以及特殊染色法

10、（如：莢膜、芽胞、鞭毛等）2.分離和鑒定（確診的最可靠方法）鑒定的主要內(nèi)容：培養(yǎng)特征形態(tài)特征生化反應(yīng) 血清學鑒定毒力試驗藥物敏感試驗3.病原菌抗原的檢測（簡便快速）4.核酸檢測 PCR技術(shù)、核酸雜交、芯片技術(shù)等5.抗體檢測概念 用已知抗原檢測病人血清或其他體液中未知抗體及其量的變化，可作為感染性疾病的輔助診斷。適用范圍 適用于抗原性強，以及病程較長的傳染病診斷影響因素 很多，如早期應(yīng)用抗菌藥物及年老、體弱、免疫功能低下等。檢查方法 直接凝集試驗 肥達試驗(傷寒、副傷寒)、外斐試驗(立克次體)、顯微凝集試驗(鉤端螺旋體)等 中和試驗 抗O試驗(鏈球菌性風濕病) 補體結(jié)合試驗 診斷Q熱柯克斯體 乳

11、膠凝集試驗 流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌等 ELISA 廣泛應(yīng)用于細菌、病毒等多種病原體的微生物學診斷和流行病學調(diào)查第二節(jié)、病毒學檢查一、標本的采集與送檢基本原則與細菌的相似，但還要特別注意：對本身帶有雜菌或易受污染的標本，分離培養(yǎng)時應(yīng)使用抗生素。低溫保存并盡快送檢，因病毒在室溫易失去活性。血清學診斷標本應(yīng)采集發(fā)病初期和病后23w內(nèi)各一份血清，觀察其抗體的動態(tài)變化。二、病毒的分離與鑒定（金標準）病毒的分離 1. 動物接種 2. 雞胚培養(yǎng)：按病毒種類接種不同部位 絨毛尿囊膜 天花病毒、痘苗病毒、HSV等 尿囊腔 流感病毒、腮腺炎病毒等 羊膜腔 流感病毒的初次培養(yǎng) 卵黃囊 某些嗜神經(jīng)病毒3. 細胞培

12、養(yǎng)：病毒分離鑒定中最常用的方法。 按其生長方式分為單層培養(yǎng)和懸浮細胞培養(yǎng) 按來源、染色體特征及傳代次數(shù)等分為原代細胞、二倍 體細胞和傳代細胞系病毒在培養(yǎng)細胞中增殖的指標1.細胞的變化 細胞病變效應(yīng)（cytopathic effect, CPE）：有些病毒在細胞內(nèi)增殖時可引起特有的細胞病變。 細胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落等； 鄰近的細胞相互融合形成巨細胞(融合細胞)如：麻疹病毒、巨細胞病毒； 在培養(yǎng)細胞中形成胞質(zhì)或核內(nèi)包涵體，如狂犬病病毒、麻疹病毒2.紅細胞吸附(hemadsorption, HAd) 具有血凝素的病毒（流感病毒等），使受染細胞膜含有病毒血凝素抗原成分，能與紅細胞結(jié)合出現(xiàn)紅細

13、胞吸附現(xiàn)象，以檢測是否有病毒在細胞內(nèi)增殖。3.干擾現(xiàn)象(interference) 某些病毒感染細胞時不出現(xiàn)CPE、Had等變化，但能干擾在其后感染的另一病毒的增殖，從而阻抑后者所特有的CPE。4.細胞代謝的改變 培養(yǎng)液的PH改變 病毒的數(shù)量與感染性測定常用的方法：蝕斑測定法和50%組織細胞感染量（ID50或TCID50） 空斑形成單位（PFU）：可測定病毒數(shù)量，空斑（P1aque）是病毒在單層細胞中增殖并擴散而形成的不易著色的病灶區(qū)。一般是由一個感染性病毒體大量復制形成，類似細菌的菌落，稱為空斑形成單位。病毒懸液中感染性病毒量以每毫升中的空斑形成單位數(shù)來表示。 50組織細胞感染量（TCID5

14、0） 是病毒毒力測定的方法，應(yīng)用不同稀釋度的病毒懸液接種動物、雞胚或細胞培養(yǎng)，引起50發(fā)生病變或死亡的最小病毒量?？梢怨烙嫴《靖腥镜膹娙醭潭燃昂?。 新分離病毒的鑒定病毒核酸類型的測定 DNA病毒和RNA病毒理化形狀的測定 包括病毒顆粒大小及結(jié)構(gòu)、衣殼對稱類型、有無包膜等形態(tài)學觀察 通過電鏡和免疫電鏡檢查血清學鑒定 病毒型別的最后鑒定須靠血清學方法基因測序和生化對比三、病毒感染的血清學診斷1.中和試驗 病毒在活體內(nèi)或細胞培養(yǎng)中被特異性抗體中和而失去感染性的一種試驗，可用來檢查患者血清中抗體的消長情況，也可用來鑒定未知病毒或研究病毒的抗原結(jié)構(gòu)。適用于人群免疫情況的調(diào)查。2. 補體結(jié)合試驗 用已知

15、病毒可溶性補體抗原來檢測病人血清中相應(yīng)的補體抗體。3.血凝抑制試驗 相應(yīng)的抗體與病毒結(jié)合后，阻抑了病毒表面的HA與紅細胞的結(jié)合。常用于粘病毒及乙型腦炎病毒感染的輔助診斷及流行病學調(diào)查，也可鑒定病毒的型與亞型。4.凝膠免疫擴散試驗 主要用于診斷HBV與乙型腦炎病毒等感染。四、病毒感染的快速診斷形態(tài)學檢查 1.電鏡和免疫電鏡檢查 2.普通光學顯微鏡檢查病毒蛋白抗原檢查 1.免疫熒光法 2.固相放射免疫測定（SPRIA） 3.酶免疫測定（EIA）特異性IgM抗體的檢測檢測病毒核酸 1.核酸雜交技術(shù) 斑點雜交、DNA印跡技術(shù) 2.核酸擴增技術(shù) 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reati

16、on,PCR)連接酶鏈反應(yīng)(ligase chain reation,LCR)反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR) 3.基因芯片技術(shù)(gene chip)第四節(jié) 特異性預(yù)防與治療 特異性防治是應(yīng)用獲得性免疫的原理，給機體注射或服用病原微生物抗原（包括類毒素）或特異性抗體以達到預(yù)防和治療的目的。這種方法稱為人工免疫(artifical immunization)。 人工免疫分為人工主動免疫和人工被動免疫。 人工主動免疫(artifical active immunization)：將疫苗及類毒素（抗原）接種于人體，使機體主動產(chǎn)生獲得性免疫力。主要用于預(yù)防。 人工被動免疫(artifical passi

17、ve immunization)：輸入含有特異性抗體的免疫血清、純化免疫球蛋白抗體或細胞因子等免疫制劑，使機體立即獲得特異性免疫力的過程一、人工主動免疫疫苗 1. 死疫苗(killed vaccine) 用物理或化學方法將其殺死病原微生物，但仍保持其抗原性的一種生物制劑。如霍亂、百日咳、傷寒、鉤端螺旋體疫苗等。 2. 活疫苗(living vaccine) 通過毒力變異或人工選擇發(fā)而獲得的減毒或無毒株，或從自然界篩選得到的毒力弱毒或無毒株經(jīng)培養(yǎng)后制成的疫苗亦稱減毒疫苗(attenuated vaccine) 。如BCG、鼠疫、脊髓灰質(zhì)炎等減毒活疫苗。死疫苗和活疫苗各有優(yōu)缺點，見下表。 3. 新

18、型活疫苗 活疫苗與死疫苗的比較區(qū)別點活疫苗 死疫苗制品特點減毒或無毒的疫苗 死菌，仍保持免疫原性制備方法通過非正常培養(yǎng)減毒株通過物理化學方法使病原體失活接種次數(shù)1次 23次接種量量小 量大接種反應(yīng)可在體內(nèi)增殖，類似于在體內(nèi)不增殖，可出現(xiàn)發(fā)熱、全 輕型感染或隱性感染 身或局部腫痛等反應(yīng)免疫的類型體液免疫和細胞免疫 體液免疫免疫效果較好，維持長(15年) 較差，維持短(0.51年)毒力回升有可能 不可能安全性對免疫缺陷者有危險 安全性好疫苗穩(wěn)定性相對不穩(wěn)定 相對穩(wěn)定保存不宜保存，4存活2w，宜保存，4存活1年 真空凍干可長期保存生產(chǎn)和成本生產(chǎn)較復雜，成本高 生產(chǎn)簡單，成本低 4.基因工程疫苗 利用

19、基因工程方法獲得帶有病原體保護性抗原表位的目的基因，將其導入原核或真核表達系統(tǒng)，表達該種保護性抗原，提純后研制成疫苗。 5.重組載體疫苗 將編碼某一蛋白抗原的基因轉(zhuǎn)入減毒的病毒或細菌而制成的疫苗。 6.合成疫苗 根據(jù)病原體抗原的氨基酸序列合成的多肽作為疫苗。 7.亞單位疫苗 利用微生物的某種表面結(jié)構(gòu)成分（抗原）制成不含有核酸、能誘發(fā)機體產(chǎn)生抗體的疫苗，稱為亞單位疫苗 。 8.DNA疫苗 9. 轉(zhuǎn)基因植物疫苗 將編碼某一病原體保護性抗原的基因轉(zhuǎn)入植物并在植物中表達，當人們吃這些植物性食物的同時，完成一次預(yù)防接種。10. 治療疫苗 以治療為目的的一種新興疫苗。 類毒素 細菌外毒素經(jīng)0.3-0.4甲醛處理后，毒性消失而仍保持其免疫原性，即成類毒素。如DPT三聯(lián)疫苗，可同時預(yù)防白喉、百日咳、破傷風三