葡聚糖凝膠層析脫鹽

1、葡聚糖凝膠層析脫鹽 生化實驗六1學習凝膠層析的工作原理和操作方法；掌握利用葡聚糖凝膠層析進行蛋白質脫鹽的技術。 目 的2原 理凝膠層析又稱凝膠過濾，分子篩或排阻層析。凝膠過濾的主要裝置是填充有層析介質的層析柱。凝膠是一種具有多孔、網(wǎng)狀結構的分子篩。利用這種凝膠分子篩對大小、形狀不同的分子進行層析分離，稱凝膠層析 。3原 理1、層析介質的特點 （1）遇水為不溶解的固相； （2）是化學惰性物質； （3）離子基團含量少； （4）顆粒大小和網(wǎng)眼均勻； （5）機械強度較強； （6）具有可選擇的多種孔徑。4原 理O 目前使用較多的是葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠及其衍生物。 葡聚糖凝膠（商品名稱S

2、ephadex）是最常用的層析介質。它是由一定平均分子量的葡聚糖和交聯(lián)劑1-氯-2,3-環(huán)氧丙烷（CH2-CH-CH2Cl）交聯(lián)成的具有三維結構不溶水的高分子化合物。調節(jié)葡聚糖和交聯(lián)劑配比，可以獲得網(wǎng)眼大小不同，型號各異的凝膠。5原 理當葡聚糖分子量越小，交聯(lián)劑用量越大，則交聯(lián)度越大，凝膠網(wǎng)眼越小，吸水量越小，G值也越小。G值表示每克干膠吸水量（mL）的十倍。例如Sephadex G-25其吸水量應為2.5mL/g干膠。常用的葡聚糖凝膠有多種規(guī)格，如G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100等。6原 理2、分離原理 當混合樣液加到凝膠柱上，隨著洗脫劑而通過凝膠柱時，分子大小不

3、同的物質受到不同的阻滯作用。 顆粒接近或大于網(wǎng)眼的分子，不能進入凝膠的網(wǎng)眼中，在重力作用下它們隨著溶劑在凝膠顆粒之間沿較短流程向下流動，受到的阻滯作用小，移動速度快，先出層析柱（此現(xiàn)象叫作被排阻。被排阻的最小分子量稱為該規(guī)格凝膠的排阻極限）； 顆粒小于網(wǎng)眼的分子可滲入凝膠網(wǎng)眼之中，它們被洗脫時不斷地從一個網(wǎng)眼穿到另一個網(wǎng)眼，逐層擴散，阻滯作用大，流程長，移動速度慢，因而后出層析柱。7原 理8原 理9原 理10操作步驟1、層析柱的準備（1）清洗：每組取一支層析柱，用清水沖洗干凈。（2）安裝與檢查：檢查出口裝置中尼龍綢或燒結濾板是否完好干凈。安裝層析柱，讓其垂直固定于滴定臺架上。對準出口處，放一只

4、250mL燒杯。向層析柱內灌洗脫劑，打開出口螺旋夾，檢查有無滲漏、出口乳膠管是否通暢等情況。（3）排氣泡：保持柱內一定的水位，用手指彈擊柱壁，部分氣泡會從溶液中上浮排出。出口處的小氣泡易停留在螺旋夾附近的乳膠管內，要想法排盡，否則會影響分離結果，排氣完畢，保留柱內12cm高水位，關緊螺旋夾。（4）標記高度：在距頂端810cm處做一標記，作為衡量灌裝層析介質床體高度（1517cm）的依據(jù)。11操作步驟2、裝柱 每組用50mL燒杯取溶脹的凝膠懸漿2530mL，靜置片刻，觀察凝膠沉淀與水的體積之比，約為1:1即可，否則應作調整。 輕輕攪勻杯中凝膠，用玻璃棒引流入柱，打開出水口，并不斷地向柱內補充凝膠

5、，直到凝膠沉淀高度位于標記上方約2cm為止，凝膠柱內若有氣泡和斷層或柱床表面干水和歪斜，都將影響分離效果。必要時，需倒出凝膠，重新裝柱。12操作步驟3、平衡 取15mL洗脫劑，用滴管沿柱內壁旋轉著緩緩流下，不可沖動膠平面，打開出水口，經(jīng)洗脫液的流動，一方面清洗內壁，另一方面使膠床收緊。洗脫平衡完畢，膠床上方保留約4cm高水位，關閉出水口。此時，膠床高度15cm為宜。4、準備收集 取6只干凈的刻度試管（除凈試管內殘留的水），16編號，并在試管2mL處作一標記。13操作步驟5、上樣與收集 打開出口排水，當膠床與上方水層的彎月面相切時，加入0.6mL混合樣液。上樣完畢，開始收集一號管。每管收集洗脫液

6、2mL。 當樣液進入膠床，其彎月面與膠平面相切時，暫停排液，用滴管將洗脫劑沿柱內壁旋轉著加入1cm高水位，然后排液，至其彎月面與膠平面相切，再緩緩注入35cm高的洗脫劑。6、洗脫 不斷向柱內加洗脫劑，保持膠床上水位35cm。出口流速控制在每6秒1滴，直至收集到6號管達2mL。14操作步驟7、鑒定 另取6只干凈試管，按收集順序將洗脫液一分為二。 第一排每管加2滴BaCl2，根據(jù)白色沉淀多少，判斷SO42-在各管中的濃度。 第二排每管加1mL考馬斯亮藍G-250試劑，根據(jù)藍色情況，判斷蛋白質在各管中的濃度。將結果記錄于下表中。 若鑒定的第6號管中，仍有樣品，表明洗脫和收集不夠，需增加7號、8號15

7、操作步驟8、再生 鑒定完畢，打開出水口，繼續(xù)用倍床體積洗脫劑洗脫，洗脫后關閉出口，以備下次使用。161、根據(jù)實驗結果，在同一坐標系中，以收集的管號為橫坐標，檢測物質的量為縱坐標，繪制二條（蛋白質及（NH4）2SO4）洗脫曲線。2、分析混合樣品分離效果。結果處理17 檢查膠平面是否水平； 加樣品及洗脫液時勿沖到膠平面； 控制流速；注意事項18思考題 半透膜透析超濾離子交換色譜等蛋白質脫鹽的方法：19思考題 1、凝膠的選擇：視分離混合物的組成而定，是大分子物質與小分子物質分開，即組別分離；還是相對分子質量比較接近的物質進行分離，即分級分離。 選擇凝膠的另一方面是凝膠的顆粒大小。顆粒小，分辨率高，但

8、流速慢，實驗時間長，有時會造成擴散嚴重；顆粒大，分辨率低。但條件得當，也可以得到滿意的結果。影響凝膠分離效果的因素：20思考題 2、柱子的影響：柱的長短粗細對層析效果都會產(chǎn)生影響。一般柱內徑為1cm，如果樣品較多，最好用2-3cm。直徑太小時會發(fā)生“管壁效應”。即柱管中心組分移動較慢，管壁周圍移動較快。進行脫鹽時，柱高50cm比較合適；分級分離時，100cm就足夠了。3、凝膠的裝填：要均勻，不能有斷路或氣泡。4、加樣：樣品濃度和黏度合適。一般樣品所用體積為柱體積的1-4%。影響凝膠分離效果的因素：21思考題 5、洗脫：洗脫液只要能溶解被洗脫物質并不使其變性就可以了。洗脫速度要恒定且合適。一般來講，洗脫速度慢，一些樣品可以與凝膠基質充分平衡，分離效果好。但洗脫速度過慢會造成樣品擴散加劇，區(qū)帶變寬，切實驗時間大大延長。6、分配系數(shù)Kav ：Kd = （Ve-Vo）/（Vt-Vo） 影響凝膠分離效果的因素：22相關知識Vt：床的總體積=外水體積+內